CRISPR/Cas9系統介導敲除CSN2基因奶山羊胎兒成纖維突變細胞的制備

賈啟鵬申培磊張歡張勇，

（1. 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070）

CRISPR/Cas9系統介導敲除CSN2基因奶山羊胎兒成纖維突變細胞的制備

賈啟鵬1申培磊2張歡1張勇1，2

（1. 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070）

旨在研究β-酪蛋白（β-casein，CSN2）對奶山羊泌乳性能的影響，利用CRISPR/Cas9系統敲除奶山羊胎兒成纖維細胞（GFFs）CSN2基因，為轉基因動物模型構建提供核供體。針對CSN2第二號、八號外顯子設計5個靶向CSN2基因sgRNA（T1、T2、T3、E1和E2），與PX330-eGFP載體連接，構建PX330-eGFP-sgRNA敲除表達載體，經T7E I酶切實驗評估敲除效率；選擇第八號外顯子敲除效率最高sgRNA，構建PX330-Neo-sgRNA敲除載體，將PX330-eGFP-sgRNA T 及PX330-eGFP-sgRNA E與PX330-Neo-sgRNA E組合轉染細胞，經流式分選、G418藥篩獲得敲除CSN2基因細胞。Western blot測定轉染細胞CSN2表達情況。測序結果表明各sgRNA均正確連入PX330表達載體中，T7E 1酶切實驗表明sgRNA T1、sgRNA E2敲除效率最高達34.9%和25.9%；經熒光定量PCR及免疫熒光檢測結果表明，eGFP+Neo轉染組CSN2敲除細胞比例顯著高于eGFP+eGFP轉染組（P<0.05）。綜上表明，CRISPR/Cas9系統可有效應用于奶山羊胎兒成纖維細胞基因編輯，產生的突變細胞為制備CSN2基因敲除奶山羊提供核供體材料。

奶山羊；CRISPR/Cas9系統；敲除；β-酪蛋白

基因編輯技術在構建動物模型及研究基因功能等方面發揮重要作用。傳統生產重組蛋白是通過基因打靶技術將外源基因導入動物原核期受精卵獲得轉基因動物，使重組蛋白在動物乳腺中特異表達，國內外學者分別通過制備轉基因小鼠、奶山羊、奶牛等動物乳腺生物反應器獲得人溶菌酶（Human Lysozyme，HLZ）［1］、人抗胰蛋白酶（Human a1-antitrypsin，al-AT）［2］、人凝血IX因子（Human clotting factor IX，hFIX）［3］及人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）［4］等重組蛋白。

然而，利用乳腺生物反應器生產外源蛋白難以實現產業化發展，其中，重組蛋白表達量低是主要限制因素，究其原因可能是外源基因在動物基因組中的隨機整合，受到鄰近染色體影響［5］或插入位點受到內源性基因抑制引起［6，7］。而利用基因編輯技術將外源基因定點插入到乳蛋白啟動子之后，利用乳蛋白上下游調控序列指導外源蛋白表達，成為制備高效穩定動物乳腺生物反應器的新方向［8］。Wright等［2］將外源基因定點整合到乳蛋白啟動子之后，獲得轉基因綿羊乳汁中人抗胰蛋白酶表達量高達35 g/L。而Naruse等［9］將人類II型膠原蛋白基因插入到牛β-酪蛋白啟動子表達載體后，構建小鼠乳腺生物反應器模型，結果發現小鼠在泌乳期外源蛋白表達量僅在10-50 μL/mL。Marcelo等［10］研究發現乳蛋白啟動子在轉基因動物中的基因拷貝數對外源蛋白的表達也有很大影響，研究表明含有6-10個基因拷貝數的小鼠中，其乳汁中重組人GH蛋白的表達量達2.63 mg/mL。而較低拷貝數（2-3）的小鼠的表達量僅為1 mg/mL；然而，雖然可以將外源基因定點整合到乳蛋白啟動子之后，但不同動物外源蛋白表達量相差較大，且大多處于較低水平。

近年來，一種成簇規律間隔回文段重復序列及鄰近相關基因（CRISPR/Cas9），在細菌［11］、動物［12］、植物［13］以及人類細胞［14］上都表現出強大的基因編輯能力。同時，有研究表明敲除α-乳蛋白基因的小鼠乳汁變得黏稠，甚至無法泌乳哺乳后代，而利用基因打靶技術置換人α-乳蛋白基因后，小鼠泌乳機能恢復正常，人α-乳蛋白也有表達［15］。而在敲除小鼠β-酪蛋白基因后，小鼠泌乳及繁殖均未受到影響，只是乳汁中酪蛋白膠粒直徑減小［16］，小鼠與大動物之間畢竟存在較大差異，因此有必要探究β-酪蛋白對奶山羊泌乳性能的影響。為此，本實驗利用CRISPR/Cas9 系統對奶山羊胎兒成纖維細胞的β-酪蛋白基因進行敲除，篩選高效敲除效率sgRNA，并獲得敲除CSN2基因的突變細胞，為制備CSN2基因敲除奶山羊提供核供體材料，為研究β-酪蛋白對動物泌乳性能影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 HSW24型恒溫水浴鍋、THZ-82A型恒溫搖床、電子天平PCR儀（Bio-Rad）、凝膠成像儀（Bio-Rad Universal Hood II）、熒光顯微鏡、CO2培養箱、高壓蒸汽鍋、渦旋振蕩儀。

1.1.2 實驗材料 奶山羊胎兒成纖維細胞F2代（西北農林科技大學動物醫學院惠贈），限制性內切酶BbsⅠ、T4連接酶（M0202L）均購自美國NEB公司；一抗（Rabbit Anti-Beta casein）及二抗（Mouse Antirabbit-Lg G）均購自北京博奧森生物技術有限公司，G418（新霉素）和胰蛋白酶購自GBICO公司；脂質體（LipofectamineTM2000）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 靶位點sgRNA的選擇 參照奶山羊β-酪蛋白基因（ID：100860784），按照 “20N+NGG”原則在第二、八外顯子處設計5對特異識別靶序列DNA的sgRNA寡聚核苷酸鏈，分別在編碼鏈5'端添加CACC，非編碼鏈3'端添加AAAC，由上海金唯智公司合成，sgRNA序列見表1。

1.2.2 載體構建 sgRNA寡聚核苷酸鏈經程序性退火（95℃ 5 min自然降至室溫），連入含Bbs I酶切位點的膠回收產物PX330-eGFP（本實驗室保存）載體中，通過測序驗證正確連入后，分別命名為PX330-eGFP-sgRNA T1、PX330-eGFP-sgRNA T2、PX330-eGFP-sgRNA T3。

1.2.3 敲除效率鑒定 培養奶山羊胎兒成纖維細胞并將其分為PX330（陰性對照組）、PX330-eGFP-sgRNA T1/T2/T3和PX330-eGFP-sgRNA E1/E2，按照5 μg DNA與10 μL脂質體轉染細胞，48 h后經流式分選獲綠色熒光細胞，擴大培養后提取細胞基因組DNA，擴增各靶點片段上下游共計685 bp（擴增引物F：5'-TCAAAGACCCACTGAATA-3'；R：5'-ATGGCTGAGGTAGGTTTA-3'）及819 bp（擴增引物F：5'-CTTTCTCCAACCGTCAT-3'；R：5'-TGCCTCCAATCTCCTAA-3'），經凝膠成像鑒定條帶單一，PCR純化后，使用T7E I酶切檢測敲除效率，反應體系：目的片段200 ng；NEB buffer 1 μL；95℃，5 min；95-85℃（-2℃/s）；85-25℃（-0.1℃/s）；12℃保存，然后加入T7E I酶 1 μL，37℃反應20 min，2% 瓊脂糖凝膠電泳20 min。突變條帶百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值。

表1 設計的靶序列sgRNA的寡聚核苷酸序列

1.2.4 Western blot檢測 提取PX330-eGFP-sgRNA T質粒轉染后細胞總蛋白，經SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉30 min，分別加入1∶300比例稀釋的一抗（Rabbit Anti-Beta casein）和1∶500比例稀釋的鼠抗兔抗體（Mouse Anti-rabbit-Lg G），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，使用DAB顯色并拍照。

1.2.5 PX330-Neo-sgRNA質粒構建及共轉染 選擇第八外顯子處具高效敲除效率sgRNA，構建PX330-Neo-sgRNA E1敲除載體，測序鑒定正確連入后，按照如下組合轉染細胞：

A方案：PX330-eGFP-sgRNA T和 PX330-eGFP-sgRNA E；B方案：PX330-eGFP-sgRNA T和PX330-Neo-sgRNA E。

人才的培養靠教育，教師占據教育的主導地位，建設一支人員精干、結構合理、專兼結合的“雙師型”教師隊伍，是提高高職旅游專業教師教育教學質量的重要保證。郭義祥認為，解決的途徑有兩種，內部培養和外部引進。內部培養指的是課任教師要在旅游專業上明確主攻方向，加強社會實踐和學習交流；外部引進主要是聘任酒店以及旅行社一線高技能工作人員以及專家學者。

其中，A方案陽性細胞基因組，按B方案轉染細胞48 h后，經流式分選后繼續培養細胞，加入800 μg/mL G418進行藥物篩選，當發現細胞大量死亡時，降低G418濃度至200 μg/mL，直至出現單克隆細胞，停藥繼續擴大培養，提取細胞基因組，擴增靶點上下游8 288 bp片段（擴增引物F：5'-AAA GACCCACTGAATACTAAAGAGACCTCATTG-3'；R：5'-TGCCTCCAATCCTAAAGCTTACCAAAAG-3'），使用T7E I酶切鑒定大片段敲除效率。

1.2.6 熒光定量PCR 在CSN2第七號外顯子設計熒光定量PCR檢測引物（F：5'-ACAGCCTCCCACAAAA-CATC；R：5'-AAGACTGGACCAGAGGCAGA-3'），分析不同敲除載體組合轉染組細胞CSN2 mRNA表達情況，反應體系為20.0 μL：上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2.0 μL、2×QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Mix 10.0 μL和ddH2O 7.5 μL。反應程序如下：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，45個循環；60℃-94℃熔解曲線。

1.2.7 細胞免疫熒光染色 接種細胞于24孔板中，待其匯合度達30%-40%，經固定及透析處理后，使用5%脫脂奶粉封閉30 min，加入1∶300稀釋一抗（Rabbit Anti-Beta casein），4℃過夜孵育，以1∶500稀釋二抗（Mouse Anti-rabbit-Lg G），避光作用2 h，DAPI染核并于熒光顯微鏡下觀察、拍照，使用Image J對熒光圖片進行自動熒光定量分析。

2 結果

2.1 PX330-eGFP-sgRNA載體構建

使用各Oligo F與PX330-檢（R：5'-CGGGTACCTCTAGAGCCATT-3'）進行菌液PCR，得一條大小為196 bp的特異性條帶，與預期結果相符，將正確菌落送測序，測序結果與sgRNA序列完全匹配，表明sgRNA打靶載體構建成功（圖1）。

2.2 敲除效率鑒定

按5 μg DNA與10 μL脂質體混合轉染細胞，48 h后經流式分選儀分選細胞，提取細胞基因組DNA，PCR擴增靶點基因后送測序，使用Chromas觀察靶點處圖譜，結果（圖2）表明sgRNA T1、sgRNA T3 及sgRNA E1、sgRNA E2均發揮出切割作用，即峰圖靶點處出現不同程度的疊峰，sgRNA T2作用靶點圖譜未出現任何疊峰，可能是未發揮作用或發揮作用后經過了正確的修復。

使用T7E I酶切鑒定各sgRNA敲除效率，突變條帶所占百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值，切出多條條帶可大致反映突變效率，其sgRNA 敲除效率分別為34.9%、1.7%、28.9%、2.9%和25.9%（圖3）。

圖1 Oligo退火產物連接PX330-eGFP菌落PCR電泳圖

單克隆測序結果與PCR產物測序結果相吻合，其中堿基突變范圍在2-31 bp之間，結果（表2）表明sgRNA T1和sgRNA E2具有較高敲除效率。

2.3 Western blot檢測

分別提取PX330-eGFP-sgRNA T轉染細胞總蛋白，經SDS-PAGE檢測奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2表達情況，結果（圖4）顯示sgRNA T2質粒轉染組細胞CSN2有表達，與測序結果吻合，表明sgRNA T2 無效，而sgRNA T1與sgRNA T3質粒轉染細胞CSN2未表達，表明sgRNA T1與sgRNA T3能有效敲除奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2基因。

圖2 奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2靶基因PCR產物測序圖譜

圖3 T7E I酶切測效圖

2.4 PX330-Neo-sgRNA載體構建

使用Oligo-CSN2-E8-F1與PX330-檢-R進行菌液PCR，得一條大小為191 bp特異性條帶（圖5），與預期結果一致，經測序驗證成功連入后，命名為PX330-Neo-sgRNA E1。

2.5 長片段CSN2敲除細胞篩選

使用PX330-eGFP-sgRNA T1與PX330-Neo-sgRNA E1及PX330-eGFP-sgRNA E1兩兩組合（eGFP+ Neo，eGFP+ eGFP）轉染細胞（圖6）。使用T7E I酶切鑒定混合轉染sgRNA敲除效率，突變條帶所占百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值，其敲除效率分別為：16.2%和13%，擴增目的基因后凝膠成像檢測（圖7）發現，出現一條非特異性條帶，說明雙載體轉染奶山羊胎兒成纖維細胞，能有效對CSN2基因大片段（最長7 760 bp）進行敲除（圖8）。

表2 奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2靶點處DNA序列的結構示意圖

圖4 Western blot鑒定CSN2

圖5 Oligo退火產物連接PX330菌落PCR電泳圖

圖6 轉染及藥篩細胞圖（100×）

圖7 T7E I酶切測效圖

2.6 熒光定量PCR檢測

使用CSN2-mRNA-F/R引物進行定量PCR檢測發現，兩種不同組合方式獲得的細胞 CSN2在mRNA水平上的表達存在明顯差異（圖9）。其中eGFP+Neo組合獲得的細胞CSN2在mRNA水平表達顯著低于對照組（P<0.05），說明eGFP+Neo組比eGFP+eGFP組能獲得更高的陽性細胞率。

2.7 免疫熒光檢測

采用免疫熒光法對雙載體轉染細胞進行染色（圖10），使用Image J圖像分析軟件對細胞CSN2表達情況進行評估，結果（圖11）表明eGFP+Neo組合細胞CSN2表達明顯少于eGFP+eGFP組（P<0.05）。說明eGFP+Neo組合能提高突變細胞在正常細胞中的比例。

圖8 Cas9重組蛋白介導的GFFs大片段CSN2 基因敲除

圖9 各組細胞CSN2 mRNA表達比較

3 討論

圖 10 細胞熒光染色圖（100×）

圖 11 細胞CSN2表達統計圖

CSN2是酪蛋白家族中的主要成員之一，約占動物乳汁酪蛋白總量的80%，該蛋白能與其他酪蛋白結構形成膠團，影響動物乳汁物理性質［17］，對其在乳汁中高效表達的特性進行深入研究，將有助于改善重組蛋白在動物乳汁中高效特異性表達等問題。早期研究基因功能的主要方法有同源重組（Homologous recombination，HR）、鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）及轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術等，因其存在諸多問題，如打靶效率低、技術難度大及載體構建復雜等，難以大范圍推廣使用。新型基因編輯技術CRISPR/Cas9系統借助在靶點處產生DNA雙鏈斷裂（Doublestrand breaks，DSB），通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復機制修復DSBs，引發切割位點DNA堿基插入或缺失，從而實現基因敲除的目的，該技術因簡易、高效、低成本等優勢［18，19］，已被成功應用于小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅等多種模式動物，包括基因功能［20］、遺傳疾病治療［21］等研究。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2基因靶位點處引入突變，發現該系統發揮基因編輯的效率與靶序列sgRNA構成有關［22，23］。本實驗分別選擇5'-TN（19）NGG與5'-CN（19）NGG兩種sgRNA類型，通過T7E I酶切實驗分析發現sgRNA T1與sgRNA E1具有較高基因編輯效率，分別為34.9%和25.9%，該sgRNA類型為5'-TN（19）NGG，而sgRNA T2未表現出基因編輯作用，實驗結果表明5'-TN（19）NGG類型sgRNA具有較高基因編輯效率，與前人報道類似［24］。相同類型sgRNA表現出不同的基因編輯效率，可能與sgRNA對靶序列的結合能力有關。

CRISPR/Cas9系統對靶位點編輯會引起多種形式突變，如堿基缺失、堿基增加或替換等［25，26］，本研究靶點突變類型主要為堿基缺失，部分為堿基替換。研究發現各sgRNA引起靶點部分堿基缺失數均為3的非整數倍，造成蛋白無法正常被翻譯，通過移碼突變實現CSN2基因真正意義的敲除。通常CRISPR/Cas9系統造成DSBs所引起的NHEJ，使我們無法獲得全部基因功能，例如，長鏈非編碼區RNA（Long non-coding RNAs，lncRNA）功能［27］、框內突變［28］等。本實驗利用雙載體轉染方案，首次驗證CRISPR/Cas9系統在奶山羊細胞水平長片段基因編輯的有效性，敲除長度長達7 760 bp，通過T7E I酶切實驗分析發現eGFP+Neo組與eGFP+ eGFP組基因突變率分別為16.2%和13%，突變率處于較低水平，造成這一現象的原因有待進一步研究，不過該方法有效降低假陽性細胞，為全面深入研究CSN2基因對奶山羊泌乳性能研究提供物質基礎。

在長片段基因修飾轉基因動物制備過程中，通常使用打靶早期胚胎獲得轉基因動物，經過復雜繁程序篩選突變個體，而本實驗利用載體篩選特異性，將eGFP基因與含Neo基因的敲除載體結合，轉染奶山羊胎兒成纖維細胞，挑陽性單克隆細胞進行培養，解決了制備轉基因動物周期長，篩選陽性動物繁瑣等問題，本實驗獲得敲除CSN2基因奶山羊胎兒成纖維細胞，為制備敲除CSN2奶山羊提供材料。

4 結論

實驗成功利用CRISPR/Cas9 系統在奶山羊胎兒成纖維細胞CSN2基因靶位點處引入突變，其突變率最高可達34.9%，首次在奶山羊胎兒成纖維細胞上實現7 760 bp基因長片段的敲除，驗證該系統對奶山羊基因編輯的有效性，并優化大片段陽性細胞制備方案，獲得CSN2基因敲除的細胞為制備CSN2基因敲除奶山羊提供了核供體。

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（責任編輯 朱琳峰）

CRISPR/Cas9 System-mediated CSN2 Gene Knock-out for Preparation of Goat Fetal Fibroblasts Mutation Cells

JIA Qi-peng1SHEN Pei-lei2ZHANG huan1ZHANG Yong1，2
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

To study the effects of beta casein（CSN2）on lactation performance of goat，the CSN2 gene of goat fetal fibroblast（GFFs）were knocked out by CRISPR/Cas9 system for providing the nuclear donors for the construction of transgenic animal. Five sgRNA targeting sites（T1，T2，T3，E1，and E2）were designed for CSN2 targeting at second and eighth exons and ligated to vector PX330-eGFP，thus PX330-eGFP-sgRNA expression vector was constructed. The knockout efficiency was evaluated by T7E I enzyme digestion experiment. Moreover，the sgRNA with the high knock-out efficiency of eighth exons was selected for constructing the PX330-Neo-sgRNA expression vector. Then the PX330-eGFP-sgRNA T and PX330-eGFP-sgRNA E combined with PX330-Neo-sgRNA E were transfected into cells，and mutant cells with CSN2 knock-out were obtained by flow sorting and G418 screening. The expression of CSN2 in the transfected cell was measured by Western blot. Sequencing results showed that the sgRNA was correctly ligated to the PX330 expression vector，T7E I digestion experiments showed that the knock-out efficiency of sgRNA T1 and sgRNA E2 was 34.9% and 25.9%，respectively. The proportion of CSN2 knock-out cell in eGFP+Neo transfection group was significantly higher than that in eGFP+eGFP transfection group（P<0.05）. In summary，we draw the conclusion that CRISPR/Cas9 system would be efficiently applied to the gene editing of GFFS and the targeting mutation cell will be of the potential resourse of nuclear donor in generating CSN2 gene knock-out goat.

milk goat；CRISPR/Cas9 system；knock-out；β-casein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0218

2017-03-21

蘭州市科技局創新人才重點項目（2015-RC-7）

賈啟鵬，男，碩士研究生，研究方向：獸醫產科；E-mail：jia_qipeng@126.com

張勇，男，博士生導師，研究方向：獸醫產科學和發育生物學；E-mail：zhychy@163.com