側孢短芽孢桿菌A60的篩選及其對辣椒疫霉的室內防效測定

郝楠 仝贊華 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

側孢短芽孢桿菌A60的篩選及其對辣椒疫霉的室內防效測定

郝楠 仝贊華 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

采用平板對峙法對分離自海南43份土樣的700余株細菌進行篩選，獲得一株對辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）具有高效抑制活性的拮抗菌A60，根據形態特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析鑒定其為側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。分別在辣椒和甜椒上進行室內防效測定，結果表明，加入拮抗菌A60的辣椒，在第3天時未發病，對辣椒疫霉病的防效達100%，第5天時為95.71%，第7天仍可達到92.22%；加入拮抗菌A60的甜椒，在第3天時未發病，防效達100%，第5天時為75.26%，第7天仍達73.20%，說明拮抗菌A60能夠明顯的降低發病率和病情指數，具有較好的防病持效性。

辣椒疫霉；側孢短芽孢桿菌；生物防治

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引發的一種土傳性病害，主要危害辣椒的莖、葉和果實，侵染后可造成植株萎蔫、落葉和果實腐爛［1］。一旦發病，傳播迅速，對辣椒生產構成極大威脅，常造成辣椒減產20%-30%，甚至造成毀田絕收，嚴重影響辣椒的產量和質量［2］。當前生產上主要采用甲霜靈、霜脲氰等內吸化學殺菌劑進行防治，但疫霉菌對使用過的內吸殺菌劑極易產生抗藥性，而化學藥劑防治為主的防治措施還會產生藥劑殘留以及環境污染等問題［3-5］。所以，對辣椒疫病進行生物防治是當前辣椒生產可持續發展的必然選擇。

目前，對辣椒疫病生物防治功能菌株的研究主要集中在生防細菌、木霉及放線菌等［6-8］。側孢短芽孢桿菌是一種多功能菌株，能產生多種具有應用潛力的代謝產物，如殺蟲蛋白、抑菌物質、抗癌免疫調節物質，另外側孢短芽孢桿菌還具有解磷、解鉀、固氮等多種生物學功能［9，10］。但是，利用側孢短芽孢桿菌防治辣椒疫病的研究較少。本研究以辣椒疫霉為靶標，從海南省多地采集43份土樣中分離和篩選出對其具有較高抑制活性的菌株，并對菌株進行鑒定和室內的生防效果測定，以期為辣椒疫病的生物防治提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici），由本實驗室保存；供試辣椒品種分別為尖椒1號（Capsicum annuum L.）和津福42（Capsicum fructescens L.）。

1.2 方法

1.2.1 土樣中細菌的分離與單菌落純化 采用平板稀釋法［11］分離、純化采集自海南多地的43份土樣。分別用無菌水將各土壤樣品稀釋至 10-4、10-5和10-6g/mL，用移液管吸取 0.1 mL土壤稀釋液涂布到PB培養基上，置于 37℃培養箱中培養。48 h后挑取不同單菌落，用分區劃線法分別接種到不同的細菌培養基上37℃培養。24-48 h 觀察記錄平板上長出的菌落。挑取單菌落在PB培養基上繼續劃線進行純化培養。24-48 h 后觀察第1 次劃線純化培養菌落，再同法進行第 2 次、第3次劃線純化培養。經表形觀察和鏡檢沒有雜菌后，分別保存于新鮮試管斜面。1.2.2 辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選 采用平板對峙法［12］篩選辣椒疫霉的拮抗菌。用5 mm打孔器沿PDA培養基上辣椒疫霉菌菌落邊緣打孔，挑取生長速度較一致的病原菌塊，接種到新的PDA培養基平板中心，置28℃培養48 h后，以病原菌為圓心在平板的背面打“十”字格，以2.8 cm為半徑，用接種針分別點接純化后的不同細菌菌株于十字格的4點上，置于28℃培養，測量并記錄48-96 h平板上的抑菌圈半徑，通過比較不同菌株的抑菌圈半徑判斷抑菌性，從中挑選出抗性最強的菌株。

1.2.3 拮抗菌的生理生化特征 將拮抗菌A60劃線接種于固體PB培養基上，37℃培養箱中培養48 h后觀察拮抗菌的菌落形態。參照《常見細菌系統鑒定手冊》［13］對拮抗菌進行甲基紅試驗、V-P試驗、明膠液化、硝酸鹽、檸檬酸鹽利用試驗、酪氨酸水解、淀粉水解、氧化酶、接觸酶、吲哚反應等生理生化指標的測定。

1.2.4 16S rDNA序列分析鑒定 采用細菌基因組提取試劑盒DP302（天根生化科技有限公司）進行基因組DNA的提取，以此DNA為模板，以27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，進行菌株16S rDNA的擴增［14］。PCR擴增條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 10 min。委托上海生工生物有限公司對16S rDNA擴增產物進行測序，所得序列與NCBI數據庫中已知序列進行比對（Blast），通過MEGA5.2軟件構建系統發育樹［15］。

1.2.5 拮抗菌A60對辣椒果實的室內防效測定 將保存的A60菌株于LB固體培養基平板上活化24 h，挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養基的100 mL三角瓶中，為種子瓶。按1%接種量，接入盛有100 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，于37℃、200 r/min恒溫振蕩培養24 h，得到A60培養液。用無菌水稀釋成1×107CFU/mL濃度備用。用打孔器在生長5 d的辣椒疫霉病菌邊緣打孔，取菌塊接入裝有50 mL 無菌水的250 mL三角瓶中，28℃、180 rpm搖床震蕩培養10 min，再用無菌水稀釋成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸液備用。

將辣椒果實和甜椒果實進行表面消毒：75%酒精浸泡30 s，無菌水清洗3次。用滅菌的槍頭打孔，每個果實表面6個孔，每個處理10個果實。處理組A60培養液濃度分別為1×107、5×106、1×106、5×105和1×105CFU/mL，先在孔中分別加入20 μL無菌發酵液，2 h后加入20 μL 1×106CFU/mL的辣椒疫霉菌孢子懸液，僅接種辣椒疫霉菌組為陽性對照CK1，無菌水為陰性對照CK2。測定拮抗菌A60對辣椒疫病的防治效果，黑暗保濕48 h，28℃恒溫培養，觀察發病情況，計算發病率和病情指數。

病害嚴重度分級標準如下：0級，無??；1級，1個發病孔；2級，2個發病孔；3級，3個發病孔；4級，4個發病孔；5級，5-6個發病孔。

病情指數（%）={Σ［（各級病果數×相對級數值）］/調查總果數×5}×100%

防治效果（%）={［陽性對照病情指數-處理病情指數］/陽性對照病情指數}×100%

2 結果

2.1 辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選

從43份土樣中共分離得到700余株菌株，其中對辣椒疫霉菌具有拮抗作用的菌株73株（表1），其中抑制效果最好是菌株A60，抑菌圈半徑為11.63 mm（圖1）。該菌種保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No.5694。

2.2 拮抗菌株A60的鑒定

2.2.1 菌株形態和生理生化指標 拮抗菌A60光學顯微鏡觀察菌落大小為（0.5-1.0）μm×（2.0-5.0）μm，芽孢側生；在固體PB培養基上呈現黃褐色、扁平狀、邊緣光滑、中央略凸起；革蘭氏染色結果可變，延遲期為G-、對數期為G+、穩定期為G-。通過生理生化鑒定結果（表2），結合形態學特征，參照《常見細菌系統鑒定手冊》，將拮抗菌A60 初步鑒定為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）。

表1 73株活性菌株對辣椒疫霉抑菌圈半徑

圖1 拮抗菌株A60抑菌效果

表2 菌株A60的生理生化特征

2.2.2 16S rDNA 序列鑒定 該菌株的16S rDNA核苷酸序列長度為1 526 bp，通過與NCBI數據庫中已有的細菌序列進行比對分析，發現拮抗菌A60菌株與側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）的同源性相似性為99%。以鄰位法構建系統發育樹（圖2），可以看出A60與側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus HQ412764.1）親緣關系最接近。綜合生理生化特征及16S rDNA 序列和系統發育樹分析結果，拮抗菌株A60鑒定為側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。

圖2 菌株A60依據16S rDNA序列的系統發育樹

2.3 側孢短芽孢桿菌A60對辣椒果實疫霉病的室內防效

2.3.1 側孢短芽孢桿菌A60在辣椒果實上的防效 防效結果（表3）表明，加入濃度為1×107CFU/mL和5×106CFU/mL拮抗菌A60的辣椒，在第3 d時未發病，防效可達到100%，第5天和第7天仍可達到90% 以上防效；加入濃度為5×105CFU/mL和1×105CFU/mL拮抗菌A60的辣椒在第3天、第5天和第7天發病率均低于對照組，但防效明顯降低，說明高濃度拮抗菌A60能夠有效的降低發病率和病情指數，并且具有很好的持效性，低濃度拮抗菌A60也可以提供防治作用。

2.3.2 側孢短芽孢桿菌A60在甜椒果實上的防效 防效結果（表4）表明，加入高濃度拮抗菌A60的甜椒，在第3天時未發病，達到100%，第5天時75.26%，第7天仍可達到73.20%；當拮抗菌A60濃度降低為5×106CFU/mL時，在第3天和第5天時防效與高濃度無顯著性差異，但當第7天時防效明顯降低，說明低濃度持效性有所降低；當拮抗菌A60濃度低于5×105CFU/mL時，無明顯防治效果。說明拮抗菌A60能夠降低發病率和病情指數，并且高濃度時具有較好的持效性，但在甜椒上的防治效果比在辣椒上的稍差一些，使用時應適當增加濃度。

3 討論

近年來，側孢短芽孢桿菌作為一種多功能菌株，在生物防治、環境保護、醫學等方面都顯示了巨大的應用價值和研究前景。作為最具潛力的生防菌株之一，側孢短芽孢桿菌可產生豐富的抗菌物質，如蛋白類、脂肽類化合物、芽孢菌胺、聚酮類化合物等，對多種真菌和細菌都表現出廣譜的抑菌活性［16］。李悅等［17］研究表明側孢短芽孢桿菌B8胞外抗菌蛋白可有效抑制立枯絲核菌和辣椒疫霉菌菌絲生長，并引起菌絲畸形。張丹等［18］研究表明側孢短芽孢桿菌S62-9對大多數致病性細菌及部分真菌都具有抑制作用，其中對G+菌的抑菌效果強于G-菌，抑菌機制主要是營養競爭作用和產生抗菌肽。側孢短芽孢桿菌還可誘導植物產生系統抗性，李蔚等［19］用側孢短芽孢桿菌B8胞外抗菌蛋白處理辣椒4 d后，植株產生 PR蛋白，說明側孢短芽孢桿菌可誘導辣椒產生系統抗病性。另外，苗素平［20］研究表明添加側孢短芽孢桿菌的微生物肥料，可有效改善土壤肥力、促進作物生長。朱金英等［21］在綠源有機肥中添加不同比例的海洋側孢短芽孢桿菌（AMCC100018）可有效促進黃瓜植株生長、改善黃瓜果實的品質。

表 3 側孢短芽孢桿菌A60在辣椒果實上的防效

表4 拮抗菌A60在甜椒果實上的防效

綜上所述，側孢短芽孢桿菌具有抑菌能力強、抑菌范圍廣、生長快速等特點，還可誘導植物產生抗病性和促進植物生長，其菌體及抑菌代謝產物均可制成優良的生防菌劑。本研究將側孢短芽孢桿菌A60的菌懸液分別稀釋不同倍數進行室內的防效試驗，結果表明，拮抗菌A60能夠明顯降低辣椒、甜椒上辣椒疫病的發病率和病情指數，并且具有很好的持效性。為了更好的進行田間應用，應進一步確定其抑菌調控體系以及抑菌物質在植物、病原物和生防菌三者之間發揮作用的調控機制。隨著測序技術的逐漸發展，尤其是高通量測序技術的廣泛應用，可利用基因組學尤其是功能基因組學，包括轉錄物組學、蛋白質組學、代謝物組學、比較基因組學來研究其生防機制和調控網絡。

4 結論

本研究從43份海南土樣中分離、篩選出了73株對辣椒疫霉病菌有拮抗作用的細菌A1-A73，其中A60抑菌活性最高，對辣椒疫霉的抑菌圈半徑達11.63 mm。根據形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定其為側孢短芽孢桿菌。分別在辣椒和甜椒上進行側孢短芽孢桿菌A60的室內防效測定，結果表明，拮抗菌A60能夠明顯的降低發病率和病情指數，具有較好的防病持效性。

［1］董金皋. 農業植物病理學, 北方本［M］. 北京：中國農業出版社, 2001：402-405.

［2］李萍, 葉濤, 鄭婷, 等. 辣椒疫霉可溶性蛋白和酯酶同工酶電泳分析［J］. 安徽農業大學學報, 2015, 42（6）：915-920.

［3］張海良, 馬輝剛, 李湘民, 等. 辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性測定［J］. 江西農業大學學報, 2011, 33（2）：270-274.

［4］翟明濤, 王開運, 許輝, 等. 抗氟吡菌胺辣椒疫霉菌株的誘導及其生物學特性的研究［J］. 植物病理學報, 2014, 44（1）：88-96.

［5］何烈干, 葛艷麗, 馬輝剛, 等. 辣椒疫霉不同發育階段對氟嗎啉的敏感性研究［J］. 中國農學通報, 2016, 32（16）：123-131.

［6］趙影. 辣椒疫霉菌拮抗細菌的篩選、鑒定及其生防潛力［D］.泰安：山東農業大學, 2012.

［7］張愛民, 韓世玉, 楊紅, 等. 辣椒疫霉菌拮抗木霉菌株的分離與初步篩選［J］. 貴州農業科學, 2014（6）：87-90.

［8］劉曉瑜, 竇桂銘, 馬玉超, 等. 生防鏈霉菌SAT1的分離、鑒定及其對辣椒疫霉的生物防治潛力［J］. 廣東農業科學, 2014, 41（19）：75-79.

［9］張楠, 劉洋, 柯曉靜, 等. 側孢短芽孢桿菌S62-9抗菌肽基因的初步定位［J］. 河北農業大學學報, 2016, 39（5）：82-86.

［10］余惠榮, 李悅, 李曉菲, 等. 側孢短芽孢桿菌B8抑菌物質的理化性質及其分離純化［J］. 沈陽農業大學學報, 2015, 46（4）：398-403.

［11］ Claus D, Berkeley RCW. Bergey’s manual of systemic bacteriology［M］. Baltinore：Williams&Wilkins, 1986.

［12］趙斌, 何紹江. 微生物學實驗［M］. 北京：科學出版社, 2002：86.

［13］東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社, 2001：349-387.

［14］周泠璇, 劉婭. 紅提葡萄內生細菌的分離鑒定及灰霉病拮抗菌的篩選［J］. 生物技術通報, 2016, 32（4）：184-189.

［15］Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28（10）：2731-2739.

［16］陳潺, 陳升富, 王建宇, 等. 側孢短芽孢桿菌的應用研究進展［J］. 山東農業科學, 2015（2）：149-156.

［17］李悅, 余惠榮, 李蔚, 等. 側孢短芽孢桿菌B8對兩種植物病原菌抗菌機制初步研究［J］. 中國植保導刊, 2015（3）：12-16.

［18］張丹, 王志新, 李興峰, 等. 側孢短芽孢桿菌S62-9對常見微生物的體外抑菌作用［J］. 中國食品學報, 2017（1）：55-61.

［19］李蔚, 趙秀香, 徐千惠, 等. 側孢短芽孢桿菌B8胞外抗菌蛋白對辣椒立枯病抗病機制的研究［J］. 中國植保導刊, 2016, 36（10）：5-9.

［20］苗素平. 不同濃度側孢短芽孢桿菌對土壤與作物生長的影響［J］. 濟寧學院學報, 2016（6）：38-42.

［21］朱金英, 張書良, 郭建軍, 等. 海洋側孢短芽孢桿菌（AMCC 100018）對設施黃瓜的應用效應研究［J］. 長江蔬菜, 2014（14）：62-65.

（責任編輯 朱琳峰）

Isolation of Brevibacillus laterosporus A60 and Its Greenhouse Control Efficiency Against Phytophthora capsica

HAO Nan TONG Zan-Hua QIU De-Wen
（The Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

A60 strain with high inhibition rate against Phytophthora capsici was screened from 700 strains isolated from 43 soil samples in Hainan province. The A60 strain was identified as Brevibacillus laterosporus based on physiological and biochemical characteristics and a 16S rDNA gene sequence analysis. The control effects of A60 strain against Phytophthora on Capsicum annuum and Capsicum fructescens were determined in greenhouse. The results showed that the biocontrol efficacy of A60 strain on C. annuum L. were 100%，95.71% and 92.22% at 3rd，5th and 7th day，respectively. The control efficacy on C. fructescens were 100%，75.26% and 73.20% at 3rd，5th and 7th day，respectively. Our results highlight that the application of B. laterosporus A60 significantly reduce morbidity and disease index，i.e.，control efficacy is solid.

Phytophthora capsici；Brevibacillus laterosporus；biocontrol

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0210

2017-03-20

郝楠，男，碩士研究生，研究方向：生物農藥；E-mail：275569832@qq.com

邱德文，男，博士，研究員，研究方向：生物農藥；E-mail：qiudewen@caas.cn