探索合成生物學的方法大規模生產中藥天然產物

鄧偉欽

摘要：中藥中的有效成分絕大多數來源于植物的次生代謝的天然產物，而許多有效天然產物都來源于珍貴藥材。人們可以通過合成生物學的途徑對表達有效產物的基因進行挖掘，然后對其進行設計和標準化，通過在底盤細胞中進行裝配，可以重建細胞的代謝途徑，使之生產單一的目標產物。且合成生物學最大的特點就是工程化，將傳統的種植提取轉變為微生物發酵，進行大規模生產。

關鍵詞：合成生物學 天然產物 微生物發酵

大多數天然產物來源于植物的次生代謝途徑。在生物體內，初生代謝產物作為底物，再經復雜的體內化學反應生成了各種不同的天然產物。如萜類化合物的生物合成，它們均是由初級代謝產物IPP/DMAPP等前體經過一系列體內催化得到。早在2006年，美國加州大學伯克利分校就人工構建了酵母菌的代謝途徑并成功合成了青蒿素的前體—青蒿酸，充分證實了合成生物學方法的可行性和巨大的潛在價值。下面簡單闡述中藥天然產物的合成途徑：

一、 對中藥藥用成分次生代謝途徑關鍵酶基因的篩選與克隆

得益于高通量基因測序技術的快速發展，目前人類已經可以實現對自然界任一物種進行基因測序并獲得其完整基因組信息。與此同時，自然界生物的基因庫信息日趨完整，人們將資料共享，也使得工作進展更加順利。人們可以通過對比前后兩種物質的結構，判斷其缺少哪些化學基團，并推斷其由什么酶系進行催化，再通過尋找其基因家族逐個進行轉化實驗直到有目標產物的生成。確定下來催化基因后，只需提取其RNA并進行反轉錄獲得cDNA，再由確定下來的基因設計PCR引物，即可對催化基因進行克隆。

二、 次生代謝途徑的解析

有機化學合成歷史悠久，積累了豐富的物質化學結構及其合成過程經驗。人們現在可以在有機化學書本上找到許多物質的化學合成途徑。與中藥天然產物合成密切相關的途徑主要有乙酸-丙二酸途徑（脂肪酸類、酚類、醌類），甲戊二氫酸途徑（萜類、甾體化合物），莽草酸途徑（苯丙素類、木質素類、香豆素類），氨基酸途徑（生物堿），復合途徑（查爾酮類、二氫黃酮類）。

三、 生物元件的改造與標準化

生物元件主要有三種類型：

① 基因表達的調控元件：啟動子、終止子、核糖體結合位點、核糖開關等；

② DNA序列及質粒載體骨架序列；

③ 蛋白質結構域和蛋白質編碼序列。

如今人們已經構建了豐富的生物元件庫，如Igem registry。目前實現了強度跨度大，梯度密集的元件庫的構建，且其強度可以由軟件進行預測，為后續生物合成途徑的代謝流平衡優化與復雜遺傳環路的設計提供了堅實的保障。

四、 底盤細胞的設計與構建

為使細胞能夠專一地生產目標產物，人們需要對微生物的基因進行改造，即敲除掉大部分對表達產物無關的基因，留下的基因使其僅僅能夠維持自身基礎的生命代謝與合成目標產物。底盤細胞的設計同時遵守兩種設計思路，一種是“自上而下”的改造，即通過敲除的方法減少其基因組，實現最小基因組的裝配；另一種思路則是“自下而上”的設計，通過預測生物合成所需要的基因進行完整基因組的設計。目前大腸桿菌、啤酒酵母、鏈霉菌及枯草芽孢桿菌已被證明是非常具有潛力的異源合成細胞。但在目前技術條件下，不同來源的基因還無法與宿主基因直接整合表達，往往需要進行表達調控原件替換、密碼子優化等操作來消除種屬差異。

五、代謝途徑的裝配與集成

主要包括兩個方面：基因組裝與基因組編輯

基因組裝目前使用最廣泛的方法是GIBSON等溫一步法：需要一個線性化的載體和若干個PCR產物，在相鄰兩個DNA片段之間有20-40bp的重疊區。在反應階段，T5外切酶將DNA5端序列消化，形成了3突出的粘端，然后再50℃下使得T5外切酶失活的同時，片段之間的重疊區退火連接，最后在phusion聚合酶的作用下補平片段間的間隔區，利用Taq DNA連接酶連接DNA缺刻。

基因組編輯技術目前最普遍的莫過于CPISPR-CAS9/CRISPR-CFP1，下面講講CRISPR-CAS9：

CPISPR：規律成簇間隔短回文重復，是細菌面對噬菌體侵染的一種自我免疫機制。主要分為三個階段：

① 獲取侵染的DNA序列并插入到CPISPR基因座的重復序列中；

② CAS蛋白表達，含spacer的CRISPR序列轉錄為前體crRNA，接著加工成成熟的crRNA，在typeII中，非編碼的traRNA與crRNA的重復序列結合；

③ CAS蛋白在crRNA的介導下識別指定靶標序列并切割。

CPISPR-CAS9由sgRNA（traRNA與crRNA結合）引導與特定DNA結合，特定DNA上必須含有PAM序列（NGG），DNA被CAS9蛋白切割后雙鏈斷裂，引發體內兩套修復系統的修復，一種是錯誤傾向的非同源末端連接修復（NHEJ），一種是精確的同源重組修復（HR）（需加入一段供體DNA作為模板）。通過引入多個sgRNA，CAS9可以同時切割多個位點，可應用于大規模的染色體重排。

六、 藥用活性成分的異源合成與結構鑒定

典型例子就是青蒿酸的合成、紫杉二烯的生物合成。

在大腸桿菌內，IPP/DMAPP不是通過MVP途徑獲得的，敲除DXP還原酶基因，抑制其本身的非甲羥戊酸途徑，然后將酵母的甲羥戊酸途徑及優化密碼子的紫穗槐二烯合酶（ADS）基因轉入大腸桿菌體內，誘導其產生紫穗槐二烯。最后將源于青蒿的細胞色素P450單加氧酶基因導入催化其產生青蒿酸。

七、 代謝途徑的優化與改造

a） 密碼子偏好性優化；

b） 啟動子強弱調節；

c） 代謝支路抑制。

八、 目標產物產量提高

中藥類目標產物主要有苯丙素類、黃酮類、萜類、生物堿、甾體。

根據分離物質的極性不同，我們可以采用柱色譜進行分離，如硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂柱色譜等，還可以通過HPLC、紫外分光光度法、薄層硅膠層析等方法鑒定物質的種類，測定其含量等。

九、 總結與展望

隨著合成生物學技術的不斷發展，底盤細胞的不斷完善及基因編輯技術的不斷改進，用微生物進行天然產物的合成必將會有一個光明的前景。

參考文獻：

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