高F值寡肽液中芳香族氨基酸的脫除工藝優化

祁文翰，樓康薇，羅紅宇

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

高F值寡肽液中芳香族氨基酸的脫除工藝優化

祁文翰，樓康薇，羅紅宇

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022）

為了脫除酶解魷魚碎肉制備的寡肽液中芳香族氨基酸以提高寡肽的F值，研究了活性炭串聯靜態吸附法的脫除效果。在對活性炭型號進行篩選的基礎上，探討了溫度、pH、固液比、吸附時間對芳香族氨基酸吸附效果的影響，通過正交試驗優化了吸附工藝。結果表明，325目粉末活性炭吸附效果最好，最佳吸附條件為溫度25℃、pH為2、固液比1:25，第一次吸附時間180 min，第二次吸附時間30 min，吸附后寡肽液F值達到25.209。

F值；高F值寡肽；活性炭吸附

高F值寡肽是一個由2～9個氨基酸殘基組成的混合小肽體系[1]。在該體系中，支鏈氨基酸（BCAA:Val,Ile,Leu）與芳香族氨基酸（AAA:Trp，Tyr，Phe）的含量比值即F值應大于20[2]。高F值寡肽因獨特的氨基酸組成、生理調節功能且寡肽分子較游離氨基酸更易被人體吸收等諸多優點[2]，已逐漸成為食品與醫藥領域研究的熱點。

制備高F值寡肽的關鍵是在降低酶解液中的芳香族氨基酸含量同時，保留酶解液中的支鏈氨基酸，增大支鏈氨基酸與芳香族氨基酸含量的比值。目前去除高F值寡肽液中芳香族氨基酸的方法有很多，如凝膠過濾法、膜分離法、滲透蒸發技術、離子交換法、高效液相色譜法[3]等，但這些方法工藝復雜，成本較高，且產量較小，不適合工業化生產。活性炭吸附法不僅價格低廉，且吸附工藝簡單，可重復利用，更適合用于高F值寡肽的大規模生產。研究表明，活性炭吸附效率高，且對疏水性化合物具有極高的親和性[4]，而芳香族氨基酸與支鏈氨基酸都為疏水性氨基酸但活性炭對芳香族氨基酸的吸附作用力還包括其具有的非極性苯環側鏈與活性炭表面存在的非極性吸附，因而當兩類氨基酸同時存在時，活性炭會優先吸附芳香族氨基酸。已有文獻報道采用活性炭吸附脫除芳香族氨基酸，如華從伶[5]利用胰蛋白酶與風味蛋白酶雙步酶解米糟蛋白制得米糟蛋白寡肽液，通過活性炭一步吸附脫芳后測得寡肽液F值為37.62；孔芳[6]以Alcalase酶與風味蛋白酶雙步酶解牛乳酪蛋白制得的牛乳酪蛋白寡肽液為原料，通過活性炭一步靜態吸附去除芳香族氨基酸，所得產品的F值達到21.06。有資料顯示，米糟蛋白與牛乳酪蛋白中支鏈氨基酸含量分別占氨基酸總含量的23.79%與17.09%，芳香族氨基酸含量分別占氨基酸總含量的26.30%與9.37%，因兩種原料中支鏈氨基酸含量本身很高，故通過活性碳對芳香族氨基酸的特異性吸附很容易實現高F值。而魷魚碎肉中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸占總氨基酸含量分別為18.22%與3.81%，均較低，因而加大了活性炭吸附芳香族氨基酸的難度。已有研究表明，高F值寡肽具有輔助治療肝腦疾病、醒酒、抗疲勞、改善手術后病人蛋白質營養狀態等多種生理功能[7]，目前臨床上大多使用的是通過氨基酸配制而成的高支（支鏈氨基酸）低芳（芳香族氨基酸）的口服液。利用魷魚加工副產物碎肉制備的高F值寡肽不僅具有特有的生理活性，而且還具有小肽的優點，如小肽有特定的轉運吸收機制，可直接被機體吸收，也能直接被組織蛋白質合成利用，參與組織蛋白質的合成[8]，特別適合體虛、消化吸收功能差的人群。同時還可以提高魷魚資源的利用效率、減少環境污染。因此，本文對活性炭串聯靜態吸附去除寡肽液中芳香族氨基酸的工藝可行性進行探究，為活性炭吸附法提高寡肽F值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚加工邊角碎肉，由浙江海力生集團有限公司提供。胃蛋白酶（3 000 U/g）、風味蛋白酶（21 000 U/g）購自廣西南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；1號活性炭（200目）、2號活性炭（150目）、3號活性炭（325目）購自江蘇森森炭業科技有限公司；4號活性炭（220目）、5號活性炭（50目）購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

α-1502型紫外分光光度計（上海譜元儀器有限公司）；FJ300-SH型均質器（上海標本模型廠)；日立CR21G型高速離心機(日本日立公司)；HHS型恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司）；SHA-B型恒溫水浴振蕩器（金壇市岸頭良友實驗儀器廠）；日立 L-8900型氨基酸分析儀（日本日立公司）；PHB-4型便攜式pH計（上海儀電分析儀器有限公司）；LGJ-10型真空冷凍干燥機（河南兄弟儀器設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

原料解凍→勻漿→雙酶分步水解→高溫滅酶→離心過濾→超濾→活性炭串聯吸附→離心→OD值測定→氨基酸組成分析。

其中，超濾是采用截留分子量為2 500的超濾膜，獲得MW≤2 500 Da的寡肽酶解液組分。

1.3.2 芳香族氨基酸脫除效果的評價

支鏈氨基酸在波長為220 nm時有最大特征吸收峰，芳香族氨基酸在波長為280 nm時有最大特征吸收峰[9]，因此可以通過紫外分光光度計測定酶解液在220 nm與280 nm下的吸光值，并以OD220/OD280作為脫芳效果的評價指標反映酶解液中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的濃度比。

1.3.3 活性炭型號篩選

魷魚碎肉蛋白酶解液，經真空抽濾后取上清液，調節上清液pH，按固液比為1:20分別加入5種不同型號的活性炭靜態吸附2 h，之后于8 000 r/min離心10 min取上清液，并測定上清液（稀釋200倍）在220 nm與280 nm下的吸光度比值（OD220/OD280），篩選出芳香族氨基酸去除率與支鏈氨基酸保留率最優的活性炭型號。其中支鏈氨基酸保留率及芳香族氨基酸去除率計算方法如下。

1.3.4 活性炭吸附芳香族氨基酸的單因素試驗

選定活性炭型號后，分別改變溫度、pH、固液比、吸附時間，考察四個因素的不同水平對活性炭靜態吸附效果的影響。

1.3.5 靜態吸附工藝優化

根據單因素試驗結果，以pH、固液比、吸附時間作為影響活性炭靜態吸附脫芳效果的因素，設計三因素三水平正交試驗，以脫芳后蛋白酶解液OD220/OD280比值作為考察指標，對活性炭靜態吸附脫芳的條件進行優化。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal array design

1.3.6 二次吸附脫芳實驗

將第一次活性炭吸附后的寡肽液于8 000 r/min離心10 min，取上清液，調節上清液溫度為25℃、pH為2、固液比為1:25，考察二次吸附時間分別為15、30、45、60、120、180 min時，再次脫芳效果。

1.3.7 寡肽液氨基酸組成分析與F值的測定

利用氨基酸自動分析儀對脫芳前后寡肽液的氨基酸組成進行測定。按下式計算寡肽液的F值：

式中，Val、Ile、Tyr、Phe、Leu分別代表纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的含量。

2 實驗結果與討論

2.1 活性炭型號篩選

活性炭靜態吸附是為了最大程度脫除芳香族氨基酸的同時盡量保證支鏈氨基酸的損失率較小，以提高寡肽液的F值。因此本實驗以OD220/OD280、支鏈氨基酸保留率與芳香族氨基酸去除率為評價指標，篩選出吸附效果最佳的活性炭型號。結果如圖1。

研究表明，活性炭制作原料的差異、比表面積的大小均可以影響活性炭的吸附效果[10]。本實驗使用的1、2、3、4號活性炭均為粉末活性炭，5號為顆粒活性炭，從圖1可以看出，5號活性炭為顆粒型，比表面積較小，吸附容量小。2號活性炭吸附能力最差，且吸附后OD220/OD280過低，因而不予考慮。而其余三種粉末活性炭目數更高，比表面積更大，具有更好的吸附力。1號活性炭與3、4號活性炭相比，雖然支鏈氨基酸的保留率更高，但芳香族氨基酸的去除率和OD220/OD280都更低。3號活性炭在三項評價指標中均優于4號，這是因為3號活性炭比表面積最大，吸附容量高于其它型號活性炭，故吸附效果最好，因此本實驗選用3號活性炭（325目）作為吸附劑。

圖1 不同活性炭吸附效果比較Fig.1 Comparison of absorption result of different activated carbon

2.2 活性炭靜態吸附單因素實驗

2.2.1 溫度對活性炭吸附效果的影響

在pH為3，固液比1:20，吸附時間為3 h條件下，分別考察了溫度為 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃時活性炭靜態吸附芳香族氨基酸的效果，結果如圖2。

從圖2可以看出，伴隨溫度的變化，芳香族氨基酸去除率、支鏈氨基酸保留率與OD220/OD280值均無顯著性差異，由此說明在試驗設計的溫度范圍內，溫度對活性炭靜態吸附效果影響不大。活性炭物理吸附的過程是一個放熱過程，從熱力學的角度分析，溫度升高將導致活性炭吸附率下降[11]。本實驗結果與熱力學分析不一致，原因與活性炭對芳香族氨基酸的吸附機理有關。活性炭對氨基酸的吸附作用力主要包含靜電作用力與非靜電作用力，隨著溫度升高，堵在活性炭微孔口的分子和碳表面基團之間的靜電作用力被削弱，因此芳香族氨基酸可以順利通過微孔口，得以與自己的吸附位點接觸，在這兩種現象的共同作用下導致溫度對活性炭吸附效果影響較低。因此，綜合考慮OD220/OD280值和生產能耗因素，本試驗選擇常溫25℃為最適溫度。

2.2.2 pH對活性炭吸附效果的影響

在溫度為25℃，固液比1:20，吸附時間為3 h條件下，分別考察了 pH 為 1、2、3、4、5、6 時活性炭靜態吸附芳香族氨基酸的效果，結果如圖3。

從圖3可以看出，pH對活性炭靜態吸附的效果影響顯著，酸性條件下活性炭吸附能力最強，對芳香族與支鏈氨基酸都有較強吸附，原因可能與支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的等電點有關，兩類氨基酸的等電點均在5.48～6.02，因而當pH在低于這個范圍的酸性條件下，易使含有該類型氨基酸的蛋白質帶有正電荷進而增強了與活性炭之間的吸附效果[12]。因活性炭對芳香族氨基酸具有的非極性苯環側鏈存在的非極性吸附作用力，因而活性炭對芳香族氨基酸的特異性選擇吸附更強。脫芳反應的整體趨勢為伴隨pH升高，活性炭吸附能力降低，尤其對芳香族氨基酸吸附能力降低明顯，OD220/OD280呈先增后降的趨勢，在pH為2時達到最大，當pH為1時溶液酸性過強，蛋白質結構易遭到破壞，影響吸附效果。

2.2.3 不同固液比對活性炭吸附效果的影響

在pH為2、溫度為25℃，吸附時間為3 h條件下，分別考察了固液比為 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35時對活性炭靜態吸附芳香族氨基酸的效果，結果如圖4。

從圖4可以看出，固液比對吸附效果的影響顯著。溶液中支鏈氨基酸含量遠大于芳香族氨基酸，所以當固液比較大時，活性炭對芳香族氨基酸的結合位點達到飽和，對支鏈氨基酸仍在吸附，造成支鏈氨基酸損失率增加，同時也增加了活性炭的用量，導致離心等后續操作的困難。而當固液比較小時，溶液中芳香族氨基酸含量超過活性炭吸附容量，導致芳香族氨基酸去除率過低，OD220/OD280的數值也過小，不利于蛋白酶解液的高F值化。而當固液比為1:25時，OD220/OD280數值達到最高，因此本實驗確定固液比為1:25為最佳靜態吸附條件。

圖2 溫度對吸附效果的影響Fig.2 The influence of temperature on absorption result

圖3 pH對吸附效果的影響Fig.3 The influence pH on absorption result

圖4 活性炭固液比對吸附效果的影響Fig.4 The influence of solid-liquid ratio of activated carbon on adsorption result

2．2．4 吸附時間對活性炭吸附效果的影響

在pH為2、溫度為25℃，固液比為1:20條件下，分別考察了時間為 30、60、120、180、240、300 min 時活性炭靜態吸附芳香族氨基酸的效果，結果如圖5。

從圖5可以看出，伴隨吸附時間的增加，支鏈氨基酸的保留率逐漸降低但變化不大，芳香族氨基酸去除率逐漸升高后趨于穩定，OD220/OD280值在180 min達到最高。在30 min時支鏈氨基酸保留率最高而芳香族氨基酸去除率較低，但OD220/OD280比值已達到10．27，造成這一現象的主要原因為蛋白水解液中除支鏈氨基酸與芳香族氨基酸外還含有其他多種氨基酸，而多數氨基酸在220 nm的波長下都具有吸收，因而220 nm的吸光度只能粗略反應支鏈氨基酸的保留率，在280 nm具有特征吸收峰的氨基酸只有芳香族氨基酸[13]，因而在吸附過程剛開始時，會因多種氨基酸與活性炭吸附速度較快而導致220 nm下吸光度突降，隨著吸附的進行，當吸附解吸達到平衡后，此時通過蛋白水解液在220 nm下的吸光度反映支鏈氨基酸會更加準確。因此綜合各項指標，吸附時間為180 min時活性炭吸附效果最佳，且OD220/OD280達到最大值11．28。

2．3 活性炭靜態吸附工藝優化結果

因溫度對吸附效果影響不顯著，故確定25℃作為最適溫度，不再優化。在單因素實驗基礎上，通過三因素三水平正交試驗對活性炭靜態吸附芳香族氨基酸的工藝進行優化，結果見表2。

圖5 吸附時間對吸附效果的影響Fig．5 The influence of reaction time on absorption result

表2 正交試驗結果Tab．2 Results of orthogonal array design

表3 方差分析結果Tab．3 Results of variance analysis

由極差分析可知，三因素對活性炭靜態吸附效果的影響強弱順序為C＞A＞B。由方差分析可知，活性炭固液比與pH值對吸附效果影響顯著（P＜0．05），吸附時間對本實驗影響不顯著（P＞0．05）。通過正交實驗優化可得出本實驗的最佳工藝為A1B2C2。即pH為2、吸附時間為180 min，活性炭固液比為1:25。在此實驗條件下進行了三次平行試驗，測得脫芳后蛋白水解液OD220/OD280值達到14．97±0．21，說明此優化工藝是穩定可行的。

經氨基酸組成分析測得脫芳后蛋白水解液F值為12．81，未達到高F值寡肽要求，因而對再次吸附條件進行探究，以提高酶解液的F值。

2．4 二次吸附脫芳結果

通過單因素實驗及正交優化設計實驗可以得出，溫度對活性炭吸附效果影響不大，pH為2、固液比為1:25時活性炭吸附效果最佳，因此本實驗僅通過比較時間因素對活性炭的二次靜態吸附效果的影響，目的是將寡肽液的F值提高至20以上，以滿足高F值寡肽的要求。試驗結果見表4。

表4 吸附時間對二次吸附效果的影響Tab．4 The influence of reaction time on the second absorption result

由表4可知，隨著時間的增加，芳香族氨基酸去除率先升高并于30 min后趨于穩定，支鏈氨基酸保留率先降低，與45 min后逐漸穩定，吸附時間為30 min時的OD220/OD280比15min時顯著升高并達到最大值，之后OD220/OD280呈下降趨勢。原因主要在于酶解液經第一次吸附脫芳后，芳香族氨基酸含量降低，因而只需較短時間就達到吸附平衡，隨著時間延長反而造成支鏈氨基酸的損失，因此確定二次吸附時間為30 min，通過三次平行實驗驗證了在此條件下，二次吸附酶解液OD220/OD280達到28．81±0．11，蛋白水解液F值為25．209，滿足高F值寡肽要求。

2．5 氨基酸組成分析與F值的測定

對魷魚碎肉蛋白水解液、該水解液通過活性炭靜態吸附優化工藝進行脫芳處理后，取上清液冷凍干燥并進行氨基酸組成分析，結果見表5～7。

由表5、6可知，經過吸附，支鏈氨基酸含量占總氨基酸含量的17．30%，芳香族氨基酸含量占總氨基酸含量的1．35%，且本實驗的支鏈氨基酸保留率達到83．35%，芳香族氨基酸的去除率達到69．14%。理論上在波長為280 nm的條件下僅有芳香族氨基酸具有特征吸收峰，因而實驗中利用測定280 nm數值判斷芳香族氨基酸含量的方法可以較準確的反映出芳香族氨基酸的去除率，而220 nm波長下雖支鏈氨基酸具有最大吸收峰但仍有多種氨基酸具有吸收，因此在吸附過程中于活性炭在吸附支鏈氨基酸的同時也吸附了其他多種氨基酸，會導致通過實驗中利用測定220 nm下吸光值反映的支鏈氨基酸的保留率較低。通過氨基酸組成分析得到的芳香族氨基酸去除率與實驗中通過吸光度計算的芳香族氨基酸去除率相差不大，而支鏈氨基酸保留率確較吸光度法高出較多，驗證了這一理論。但最優條件下吸附獲得的蛋白水解液F值雖有了大幅提升，但仍僅達到12．81，并未滿足高F值寡肽液F值大于20的標準。究其原因主要為本實驗原料為秘魯魷魚碎肉，具有水分含量高，蛋白含量低的特點，且不同種類魷魚的氨基酸組成區別較大，因而酶解液中含有較多芳香族氨基酸，導致了僅通過一步吸附實現高F值，因此需要進行二次吸附，將經過一次吸附的酶解液F值進一步提高。

由表7可知，經過活性炭的二次吸附，支鏈氨基酸含量占總氨基酸含量的13．65%，芳香族氨基酸基本吸附完全，余下含量僅占總氨基酸含量的0．54%，且樣品F值達到25．209，滿足高F值寡肽F值大于20的要求，因此制備的酶解液符合高F值寡肽的要求。

表5 活性炭吸附前酶解液的氨基酸組成分析Tab.5 Result of amino acid analysis of supernatant before the adsorption

表6 活性炭一次吸附后酶解液的氨基酸組成分析Tab.6 Result of amino acid analysis of supernatant after the first time adsorption

表7 活性炭二次吸附后酶解液的氨基酸組成分析Tab.7 Result of amino acid analysis of supernatant after the second time adsorption

3 結論

通過對活性炭靜態串聯吸附脫芳工藝優化，確定了第一次活性炭常溫靜態吸附的最佳工藝為：pH為2、吸附時間180 min，活性炭固液比1:25，此條件下制備的寡肽液OD220/OD280數值達到14.97±0.21，F值為12.81。第二次常溫靜態吸附的最佳條件為：pH為2、吸附時間30 min，活性炭固液比1:25，測得二次吸附寡肽液OD220/OD280數值達到28.81±0.11，F值為25.209，滿足高F值寡肽F值≥20的要求，且芳香族氨基酸含量僅占總氨基酸含量的0.54%，為進一步的分離純化提供依據。

致謝：舟山中學2015級中美AP班的張在洖同學與本文的部分試驗及數據分析作圖工作，在此表示感謝。

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The Removal Process Optimization of Aromatic Amino Acids in High Fischer Ratio Oligo-peptide

QI Wen-han,LOU Kang-wei,LUO Hong-yu
(Food and Medicine School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

In order to remove the aromatic amino acid in the oligopeptide prepared by enzymatic hydrolysis to improve the F value of the oligo-peptide,the removal effect of the activated carbon series static adsorption method was studied.Based on the screening of activated carbon model,the effects of temperature,pH,solid-liquid ratio and adsorption time on the adsorption of aromatic amino acids were discussed,The adsorption process was optimized by orthogonal test.The results showed that the best adsorption conditions were as follows:temperature 25℃,pH 2,solid-liquid ratio 1:25,first adsorption time 180 min,second adsorption time 30 min,after adsorption the oligo-peptide liquid F value reached 25.209.

F value;high fischer ratio oligo-peptide;activated carbon adsorption

S986.2

A

1008－830X(2017)02－0122－08

2017-02-01

國家海洋局海洋公益性行業科研專項（201305013）

祁文翰（1993-），男，江蘇溧陽人，碩士研究生，研究方向：水產品精深加工.

羅紅宇（1968-），女，教授，研究方向：水產品精深加工.E-mail:lisa8919@163.com