唐山地區柴胡根腐病病原菌分離鑒定及生物學特性研究

唐山地區柴胡根腐病病原菌分離鑒定及生物學特性研究

姜峰1，馬艷芝1，客紹英1，李小芳2
（1.唐山師范學院生命科學系，河北唐山063000；2.遷西縣農牧局，河北遷西064300）

柴胡根腐病在河北唐山地區呈逐年加重趨勢，嚴重影響了柴胡的產量和質量。為了明確唐山地區柴胡根腐病病原菌的種類，在對柴胡根腐病菌分離純化的基礎上，通過菌落形態觀察與病原菌16s rDNA分析，鑒定病原菌種類，并分析了病原菌的生長特性。結果表明：通過對分生孢子等形態學觀察，初步認為柴胡根腐病病原菌屬鐮刀菌屬；應用rDNA ITS區的通用引物對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，PCR產物測序后經BLAST分析，檢測結果與形態學鑒定結果一致，確定病原菌是腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）。菌絲體在PDA培養基中的最適生長溫度為25℃，適宜生長pH值為6～8。致病菌孢子在30℃時萌發率最高；適宜萌發pH值為6～8；孢子在25℃水滴中2 h后開始萌發，9 h后萌發率達到100%；孢子臨界致死條件為50℃、10 min。

柴胡；根腐病；病原菌；生物學特性

柴胡（Bupleurum chinense DC.）為傘形科多年生草本植物，以根入藥，具有發表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效，在臨床上應用廣泛，是我國常用的大宗中藥材品種[1]。由于需求量巨大，市場上的柴胡主要為人工栽培[2]。山西、河北、甘肅等地區是我國柴胡的主要種植地[3]。

柴胡栽培過程中的主要病害為根腐病。根腐病為土傳真菌病害，一般由1種或多種病原菌在植物根部或莖部的創傷口入侵而引發，菌絲體或孢子長期存在于土壤或植株殘體中，在高溫、高濕和種植密集條件下極易引起根腐病的發生。在夏季6～8月高溫多雨季節，柴胡種植區的根腐病發病面積在15%～30%，在排水不暢地塊發病面積高達60%以上。因此，柴胡根腐病已成為影響柴胡產量和質量的主要因素之一[4]。

李勇等[5，6]研究發現，柴胡根腐病在北京地區普遍發生，其中，1 a生柴胡病害較輕，2 a生柴胡發病較重。柴胡與小麥套種地區的根腐病發病率和病情指數均高于柴胡單獨栽培區。同時還發現，同一柴胡品種在不同區域栽培，根腐病發病率和病情指數存在較大差異。說明栽培方式和環境因素對柴胡根腐病的發病率有較大影響。進一步分離柴胡根腐病致病菌，鑒定其為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），并對致病菌的生物學特性進行了研究。向瓊等[4]在陜西商洛地區的柴胡種植基地調查時發現，根腐病一般在5月中、下旬開始發病，6月中旬～7月上旬為發病盛期。引起根腐病的致病菌是腐皮鐮刀菌（F.solani）。對根腐病的預防措施主要是農業防治，即通過篩選抗性品種、輪作和控制水肥等方式，控制或減少病害的發生。朱再標等[7]研究發現，施用氮、鉀肥會顯著降低柴胡對根腐病的抗性，大量施用磷肥可以降低柴胡根腐病的病情指數；對于早期發病植株，建議采用化學殺菌劑如百菌清、甲基硫菌靈和代森錳鋅等進行灌根或噴施處理[8]。

近年來，根腐病在河北唐山地區柴胡種植基地也有發生，且呈逐年加重趨勢，嚴重影響了柴胡的產量和質量。為此，在對柴胡根腐病菌分離純化的基礎上，對其從形態學和分子生物學方面進行鑒定，以期明確唐山地區柴胡根腐病的主要致病菌及其生物學特性，為進一步的病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柴胡根腐病發病植株，2013年7月采自河北省唐山市玉田縣柴胡種植基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化采用組織分離法，從病株根部切取厚0.2 cm的病健交界處組織，先用5%的NaClO溶液表面消毒3 min，而后用無菌水沖洗3次，再用滅菌濾紙吸干，接種到PDA培養基上，25℃培養5 d。在無菌條件下，從菌落邊緣部分挑取菌絲轉接到PDA培養基上，25℃培養2～3 d，待菌絲長出后挑取菌絲進行純化，純化的菌種于4℃保存，待用。

1.2.2 病原菌的形態學鑒定將分離獲得的候選真菌分別在PDA培養基上25℃培養7 d，觀察菌落形態、顏色；用顯微鏡觀察候選真菌分生孢子形態、隔膜有無及數目、產孢結構、厚垣孢子有無及著生部位等。

1.2.3 病原菌致病性的測定

1.2.3.1 離體接種。將純化的菌株在PDA培養基上培養7 d后，加無菌水3 mL，制成濃度為107個/mL的孢子懸浮液。選取健康無病的1 a生柴胡根組織，先用清水沖洗干凈，而后用5%的NaClO溶液表面消毒3 min，再用無菌水沖洗多次，置于滅菌的培養皿中。采用針刺法，接種孢子懸浮液100 μL，以接種等量無菌水作為對照（CK）。在溫度25℃、相對濕度95%條件下培養，每處理均3次重復。

1.2.3.2 盆栽接種。選取溫室內栽培的健康1 a生柴胡植株，先用清水將根部沖洗干凈，而后用5%的NaClO溶液對根表面消毒3 min，再用無菌水沖洗多次，晾干后，用無菌手術刀片將根部切傷，將柴胡根部在濃度為107個/mL的孢子菌懸液中浸泡10 min后，栽植于直徑20 cm的花盆中，再將孢子菌懸液灌注到根部附近的土壤中，接種量20 mL/株。以灌注無菌水作為空白對照（CK），每處理接種10株。接種后置于溫室內，定期觀察發病情況。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

1.2.4.1 基因組DNA提取。柴胡致病菌在PDA培養基上25℃恒溫培養7 d后，取菌絲體0.2 g，應用CTAB法提取病原菌基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。

1.2.4.2 DNA-ITS區段擴增。用真核生物基因組中的rDNA-ITS區段通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增病原菌基因組DNA。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為25μL，包括：10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，模板DNA（約30 ng）1 μL，引物ITS1和ITS4（10 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環；最后，72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Bio-Rad凝膠成像系統觀察、照相。

1.2.4.3 純化及測序。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切取凝膠中的目的條帶，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒（上海生工）純化，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4.4 同源性分析。測序結果經BLAST（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）與NCBI數據庫中的已知序列進行同源性比較，根據同源性比較結果，結合對病原菌的形態學觀察及致病性測定，最終鑒定柴胡根腐病的病原菌。

1.2.5 病原菌的生長特征

1.2.5.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響。參照李勇等[6]方法，將病原菌先接種在PDA培養基上，然后分別放置于5、10、15、20、25、30和35℃的生化培養箱中培養，6 d后利用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3次重復。計算不同溫度下病原菌菌絲的生長速率。

1.2.5.2 pH值對菌落生長的影響。參照李勇等[6]方法，分別用1 mol/L的HCL溶液和1 mol/L的NaOH溶液調節PDA培養基的pH值至2、4、6、8、10和12，將培養基滅菌后再接種致病菌，在25℃生化培養箱中恒溫培養，6 d后測量菌落直徑。每處理3次重復。計算不同pH值下病原菌的生長速率。

1.2.5.3 孢子萌發規律的研究。參照鄒慶道等[9]方法，取1滴濃度為106cfu/mL的孢子水懸液滴于凹玻片的凹坑中央，然后將凹玻片放置于鋪有吸水紙的培養皿中，25℃恒溫保濕培養，每隔1 h隨機統計100個孢子的萌發情況。每處理3次重復。計算不同時間的孢子萌發率。

1.2.5.4 溫度對孢子萌發的影響。采用孢子懸滴萌發法，取濃度為106cfu/mL的病原菌孢子菌懸液100 μL滴入無菌凹玻片中，然后將凹玻片置于培養皿中，分別放置在5、10、15、20、25、30和35℃的培養箱中保濕培養24 h，在顯微鏡下隨機統計100個孢子的萌發情況。計算不同溫度下的孢子萌發率。

1.2.5.5 pH值對孢子萌發的影響。分別用1 mol/L的HCL溶液和1 mol/L的NaOH溶液調節孢子水懸液的pH值至2、4、6、8、10和12，放置于25℃培養箱中恒溫保濕培養24 h，隨機觀察100個孢子的萌發情況。計算不同pH值下的孢子萌發率。

1.2.5.6 孢子致死溫度的測定。取濃度為106cfu/mL的孢子菌懸液500 μL于1.5 mL離心管中，放置于恒溫金屬浴中，分別在35～70℃（其中35～50℃以5℃為間隔，51～70℃以1℃為間隔）處理10 min，之后取100 μL滴于凹玻片上，置于25℃生化培養箱中恒溫培養24 h。觀察孢子的萌發情況，測定孢子的致死溫度。

2 結果與分析

2.1 發病情況觀察

在唐山玉田地區，柴胡根腐病一般6月中下旬隨著雨水增多開始發病，7月中下旬為發病盛期。當年生柴胡即有發病，如不采取措施，第2 a發病情況加重。高溫、高濕、多雨年份發病重，反之，則發病較輕。根腐病主要造成柴胡根部腐爛，之后整個植株萎蔫、死亡。發病初期，柴胡根部在病原菌侵入點開始腐爛，而地上部分發病株與健康株之間無明顯區別，隨著根部腐爛情況的加重，在根莖交界處可以看到黑褐色病斑并逐漸擴大，更進一步根部完全腐爛，整個植株萎蔫、死亡。

2.2 菌落形態觀察

分離純化的菌株在PDA培養基上蔓延生長，氣生菌絲呈白色絨毛狀，不易產孢（圖1）。從PDA培養基上挑取少量菌絲，鏡檢發現大量分生孢子和分生孢子梗。分生孢子梗伸長、不分枝；小型分生孢子長橢圓形、腎型，單胞或雙胞，數量大，呈假頭狀聚生；大型分生孢子鐮刀型，兩端較鈍，頂胞稍彎，具1～6隔，其中3隔膜占總數的99%以上；厚垣孢子球形，表面光滑或粗糙，頂生或間生于菌絲中（圖2）。

圖1 柴胡根腐病病原菌在PDA培養基上的形態學特征Fig.1 Morphological characteristic of pathogen on PDA medium

圖2 柴胡根腐病病原菌不同類型的孢子Fig.2 Different types of spores

2.3 致病性檢測

為了明確分離菌的致病性，首先在室內用離體根組織進行接種，結果顯示，接種2 d后接種點周圍開始長出白色的菌絲體，5 d后根段布滿白色菌絲體并且開始腐爛；室內盆栽試驗發現，接種10 d后接種部位顏色變深，之后開始逐漸擴散，更進一步根部變軟，地上部分葉片逐漸卷曲、萎蔫，呈現與田間柴胡相似的發病癥狀。而對照均無發病癥狀。從發病組織重新分離病原菌，菌落和孢子形態與原接種病原菌一致。說明分離菌株為柴胡根腐病的主要致病菌。

2.4 基因組DNA提取和PCR擴增

電泳分析結果（圖3）顯示，病原菌基因組DNA長度＞10 kb，電泳條帶清晰完整，基本沒有降解。以病原菌基因組DNA為模板，用rDNA的ITS區段通用引物ITS1和ITS4擴增，得到1條400 bp左右的擴增條帶。經回收、純化及序列測定，擴增條帶實際為347 bp。

圖3 柴胡根腐病病原菌基因組DNA（左）和PCR產物（右）電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of genomic DNA extraction and PCR products

2.5 PCR擴增及測序

BLAST分析結果顯示，該擴增片段的核酸序列（登錄號：KU747010）與Gen-Bank中F.solani對應的ITS序列同源性最高，其中，與ITS序列（KR364579、KR364574、KF986692、KF986682、KF986675）的同源性為99%。分離到的鐮刀菌形態特征與腐皮鐮刀菌（F.solani）基本一致。綜合形態學觀察、致病性測定和ITS分析結果，最終確認本研究分離的病原菌為腐皮鐮刀菌。

2.6 溫度對菌絲生長的影響

溫度對柴胡根腐病病原菌的生長有顯著影響，其中，病原菌菌絲在10～35℃溫度范圍內均能生長，適宜生長溫度范圍為25～30℃，最適生長溫度為25℃；溫度為5℃時，未觀察到菌落生長（圖4）。

圖4 溫度對柴胡根腐病病原菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of temperature on hyphal extension of pathogen

2.7 pH值對菌絲生長的影響

柴胡根腐病病原菌的菌絲在pH值2～12之間均能生長，其中，pH值＜4時，菌絲生長較為緩慢；pH值為6～8時，菌絲生長良好，菌落背面呈現暗白色（圖5）。

圖5 pH值對柴胡根腐病病原菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of pH on hyphal extension of pathogen

2.8 病原菌孢子萌發規律

25℃條件下，柴胡根腐病病原菌分生孢子2 h后開始萌發，6 h后萌發率達到88%，9 h后全部萌發（圖6）。

2.9 溫度對孢子萌發的影響

溫度對柴胡根腐病病原菌孢子萌發具有顯著影響，其中，30℃條件下病原菌孢子萌發率最高，且與其他溫度處理差異均達到了顯著水平（表1），表明柴胡根腐病病原菌孢子萌發的最適溫度為30℃。而溫度≤10℃時，孢子均不萌發；溫度＞30℃時，孢子萌發率又顯著降低。

圖6 柴胡根腐病病原菌孢子的萌發規律Fig.6 Characteristics of spore germination

表1 溫度對柴胡根腐病病原菌孢子萌發的影響（%）Table 1 Effect of temperature on spore germination

2.10 pH值對孢子萌發的影響

pH值對柴胡根腐病病原菌孢子萌發有顯著影響，其中，pH值為8條件下病原菌孢子萌發率最高，其次是pH值為6處理，二者孢子萌發率為94%~95%且差異不顯著（表2），表明柴胡根腐病病原菌孢子萌發的適宜pH值為6～8。而pH值＜6或＞10時，孢子萌發率均顯著降低（表2）。

表2 pH值對柴胡根腐病病原菌孢子萌發的影響（%）Table 2 Effect of pH on spore germination

2.11 孢子的臨界致死溫度

柴胡根腐病致病菌孢子在溫度35～45℃條件下均可萌發，但是萌發率隨著溫度的升高而降低，其中，溫度＞45℃時分生孢子不能萌發，延長培養時間，仍然未見到孢子萌發（圖7）。表明柴胡根腐病孢子的臨界致死溫度為50℃，高溫處理后分生孢子無萌發現象。

圖7 柴胡根腐病分生孢子的臨界致死溫度Fig.7 Spore critical lethal temperature

3 結論與討論

近年來，由于中藥市場需求持續增長和仿野生栽培技術的推廣，中藥材種植面積迅速擴大，同時其病害問題也日益突出。根莖類中藥材由于經濟部位是根莖部，因此根腐病嚴重影響該類中藥材的產量和質量。根腐病在三七[10]、黃芪[11，12]、板藍根[13]、丹參[14，15]、川芎[16，17]等中藥材種植基地均有不同程度的發生。

引起中藥材根腐病的致病菌主要是鐮刀菌屬真菌，其中，以尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌分離報道頻率較高[18]。李勇等[5]從北京地區的發病柴胡中分離并鑒定根腐病致病菌為尖孢鐮刀菌。而向瓊等[4]認為柴胡根腐病是由腐皮鐮刀菌引起。本研究通過形態學和分子鑒定，并經過回接驗證，確認引起河北唐山地區柴胡根腐病的致病菌是腐皮鐮刀菌。這說明，不同地區的柴胡根腐病是由不同的致病菌引起。因此，更需要對不同地區的柴胡根腐病致病菌進行分離鑒定。

本研究中對柴胡根腐病菌絲體生長和孢子萌發條件進行了探索，結果表明，病原菌在PDA培養基上10～35℃條件下均能生長，最適生長溫度為25℃。在一定的溫度范圍內，升高溫度對菌絲生長有促進作用，溫度越高，菌絲生長越快；但過高溫度會對菌絲生長產生抑制作用，溫度超過30℃時菌絲生長速率急劇下降。病原菌生長適宜pH值為6～8。pH值為6～12時，病原菌菌絲生長相對較快，說明病原菌適宜在中性稍偏堿性的環境中生長。病原菌孢子在適宜的條件下2 h即開始萌發，9 h后全部萌發，且孢子在較為寬泛的溫度和pH值條件下均能很好地萌發，說明病原菌有較強的生命力。在唐山柴胡種植基地觀察發現，根腐病一般6月中下旬隨著雨水增多開始發病，7月中下旬為發病盛期。這期間當地平均氣溫為20～30℃，且全年降水也主要集中在6～8月，這種條件正適合柴胡根腐病病原菌的生長、產孢和萌發，也正是該時期柴胡根腐病高發的重要原因。

柴胡根腐病菌在適宜的條件下能夠快速生長繁殖，一旦發病，難于控制。因此，對柴胡根腐病的控制應以預防為主，定期檢查土壤及柴胡根際致病鐮刀菌的情況，及時采取措施，預防病害的發生，從而提高柴胡的質量和產量，促進種植戶增產增收。

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Identification and Biological Characteristics of Root Rot Pathogen of Bupleurum chinense DC. in Tangshan Area

JIANG Feng1，MA Yan-zhi1，KE Shao-ying1，LI Xiao-fang2
（1.Life Science Department of Tangshan Normal University，Tangshan 063000，China；2.Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Qianxi，Qianxi 064300，China）

Plate dilution method were used to identification of root rot pathogen of Bupleurum chinense DC.in Tangshan area，and pathogenicity was test through in vivo and in vitro experiments.The pathogen was preliminarily identified as Fusarium spp.according to its morphology，color and growth rate of the colonies，and morphology of macroconidia，microconidia，chlamydospores，and conidiophores．The fungal rDNA ITS was amplified and sequenced．The sequencing results was accepted by GenBank and the accession number is KU747010．The results of molecular detection and morphologic observation both showed that the pathogens causing root rot of Bupleurum chinense DC. is Fusarium solani．Pathogens optimum grow temperature and pH value were 25℃and 6-8，respectively.Under the environment of 25℃，the spore began to germinate in 2 hours and germination rate reached 100%after 9 hours. The killing conditions of spore were 50℃，10 min.

Bupleurum chinense DC.；Root rot；Pathogen；Biological characteristics

S435.672

A

1008-1631（2017）03-0045-06

2016-11-30

國家科技支撐計劃子課題項目（2011BAI07B05-4）；河北省科學技術廳項目（15456420）；唐山市科學技術局項目（15130265a）

姜峰（1976-），男，黑龍江寧安人，副教授，博士，主要從事藥用植物土傳病害生物防治研究。Tel：0315-3863212；E-mail：foodman307@163.com。