復發(fā)性自然流產(chǎn)MTHFR基因多態(tài)性與中醫(yī)證型相關性的臨床研究

王晨曄 丁彩飛

浙江省杭州市紅十字會醫(yī)院 浙江 杭州 310003

診法求索

復發(fā)性自然流產(chǎn)MTHFR基因多態(tài)性與中醫(yī)證型相關性的臨床研究

王晨曄 丁彩飛#

浙江省杭州市紅十字會醫(yī)院 浙江 杭州 310003

復發(fā)性自然流產(chǎn) 亞甲基四氫葉酸還原酶 中醫(yī)證型 腎虛血瘀

復發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)，是指2次或2次以上連續(xù)發(fā)生的自然流產(chǎn)，發(fā)生率約5%，排除常見原因，仍有50%左右RSA不明原因[1-2]。研究表明：凝血相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR），其C677T位點的突變將導致酶活性降低，同型半胱氨酸(Hcy)水平升高，可引起胎盤栓塞，從而引發(fā)流產(chǎn)[3]。本次臨床研究通過對復發(fā)性自然流產(chǎn)患者MTHFR基因分型進行檢測，探討復發(fā)性自然流產(chǎn)MTHFR基因突變特點及其與中醫(yī)證型相互關系，為中醫(yī)臨床治療復發(fā)性自然流產(chǎn)MTHFR基因突變提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 診斷標準：西醫(yī)參照《復發(fā)性流產(chǎn)的診斷和治療》[4]與同一性伴侶連續(xù)遭遇2次或2次以上在妊娠20周前的胎兒(體重≤500g)丟失。中醫(yī)辨證標準：參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]《中醫(yī)婦科臨床研究》[6]有關內容擬定。腎虛血瘀型：主癥：屢孕屢墮連續(xù)2次及2次以上,腰膝酸軟；次癥：①頭暈耳鳴；②面色晦黯；③既往月經(jīng)量少或有血塊；④夜尿頻數(shù)；⑤潮熱盜汗或畏寒肢冷；⑥眼瞼輕微浮腫；⑦性欲減退；舌脈：舌淡、苔白或舌質紫黯，舌邊有瘀點或瘀斑，脈沉細滑或澀或尺脈弱。脾腎兩虛型：主癥：屢孕屢墮連續(xù)2次及2次以上,腰膝酸軟或小腹隱痛下墜；次證：①神疲乏力；②面色萎黃或晦黯；③頭暈耳鳴；④夜尿頻多；⑤眼眶黯黑或面有黯斑；舌脈：舌淡或有齒痕、苔白潤,脈沉細弱。氣血兩虛型：主癥：屢孕屢墮連續(xù)2次及2次以上；次證：①神疲乏力；②頭暈目眩；③氣短懶言；④面色淡白；舌脈：舌質淡、苔薄白，脈細弱。腎虛血熱型：主癥：屢孕屢墮連續(xù)2次及2次以上，腰膝酸軟；次證：①月經(jīng)色深紅質稠；②面赤唇紅；③口干咽燥；④便結尿黃；舌脈：舌紅、苔黃，脈弦滑數(shù)。肝氣郁結型：主癥：屢孕屢墮連續(xù)2次及2次以上；次證：①胸脅、乳房、少腹脹痛；②脘悶不舒，時嘆息；③噯氣食少；舌脈：苔薄白或薄黃，脈弦。以上辨證均符合主癥兼具次癥中任一項結合舌質脈象，即可診斷。

1.2 排除標準：夫婦雙方中一方外周血染色體核型異常者；生殖系統(tǒng)解剖畸形者；TORCH檢測異常者；抗心磷脂抗體檢測陽性者；抗精子抗體(AsAb)檢測陽性者；夫婦ABO血型抗體系統(tǒng)檢測IgG抗A抗體、IgG抗B抗體滴度大于1∶256，RH因子陰性者；有嚴重的心肝腎疾病、自身免疫性疾病者；尿HCG陽性者。

1.3 一般資料：收集2016年1月至2017年1月在杭州市紅十字會醫(yī)院生殖科門診就診及病房住院符合不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者100例為RSA觀察組，年齡24～42歲，平均31.78±4.39歲；平均體重56.68±5.76kg。門診就診擬行孕前檢查的無不良妊娠史的育齡期健康婦女50例為正常對照組（簡稱對照組），年齡23～41歲，平均31.12±3.84歲，平均體重57.21±4.59kg。兩組年齡、體重差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 研究方法：①血標本采集：RSA觀察組及正常對照組均空腹靜脈采血，0.2%EDTA抗凝，血細胞做提取DNA用。②MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測：低滲溶血法分離白細胞，酚、氯法提取人基因組DNA。PCR反應：RT-PCR試劑與引物合成（武漢博士得生物工程有限公司）總蛋白提取試劑盒SBSCenetech公司，PCR儀（德國Biometra公司）；MTHFR：C677T引物序列，上游：5'－TGAAGGAGAAGGTGTGTGCGGGA－3'，下游：5'－AGGAGGGTGGGGTGAGAGTG－3'。PCR擴增循環(huán)條件：91℃預變性和變性各2min，56℃退火1min、74℃45s30個循環(huán)、72℃5min、4℃12h，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物進行分析。具體試驗操作由我院中心試驗室完成。

1.4.2 中醫(yī)證型分析：100例RSA觀察組患者，均由我院兩位以上主治中醫(yī)師根據(jù)患者的癥狀、體征、舌苔、脈象，四診合參，根據(jù)中醫(yī)證候診斷標準予以臨床辨證分型。

1.4.3 統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0軟件包處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分率，采用χ2檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 兩組MTHFR基因型頻率分析：見表1。

2.2 兩組3種MTHFR基因型，純合突變型TT、雜合子型CT、野生型CC中醫(yī)證型頻率分析：見表2。

表1 兩組MTHFR C677T基因型頻率[例（%）]

表2 兩組MTHFR基因型（TT、CT、CC）中醫(yī)證型頻率[例（%）]

3 討論

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸－葉酸代謝中的一個關鍵酶,其中最常見的是C677T點突變，造成堿基T替換了C，其編碼的氨基酸也由纈氨酸代替了丙氨酸，突變可直接影響酶的活性和熱穩(wěn)定性，影響葉酸的合成與代謝，體內N5-甲基四氫葉酸合成降低，導致甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成量下降，DNA轉甲基轉移酶活性降低，Hcy和S-腺苷同型半胱氨酸堆積，導致高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。妊娠期高同型半胱氨酸血癥可致血液高凝狀態(tài)，增加胎盤栓塞危險。高同型半胱氨酸血癥還可能引起絨毛膜絨毛血管化不良，造成胚胎死亡，另外由于胎盤組織中MTHFR活力缺乏，致使作為甲基間接供體的5－甲基四氫葉酸生成障礙，進一步影響嘧啶、嘌呤和核酸的代謝及DNA甲基化，使得胎兒發(fā)育必需的生物成分包括DNA和蛋白質的甲基化不足，導致RSA[7]。

中醫(yī)學將復發(fā)性流產(chǎn)歸為“滑胎”范疇。其主要發(fā)病機理為母體沖任不固及胎元不健，病因病機多為腎虛，氣血虛弱，血熱、肝郁及血瘀，病位多責之于腎，且古人曰：胞脈者系于腎，“腎藏精，主生殖”。若母體因先天腎氣不足，或房勞傷腎，或久病及腎，或孕后不節(jié)房事，導致腎精、腎氣匱乏，以致沖任虛衰，胎失所養(yǎng)，胎結不實，墮胎小產(chǎn)反復發(fā)作而成滑胎。反復流產(chǎn)易傷及沖任胞絡，導致瘀血滯留胞中，再孕后又因精血聚于下以養(yǎng)胎，匯聚之精血增加氣血運行阻力，進而加劇了瘀血形成，瘀血不去，有礙新血歸經(jīng)，不能養(yǎng)胎，最后致胎元不固而流產(chǎn)。可見墮胎之后，一則損傷腎氣，二則傷及沖任胞脈，導致瘀留胞中不能養(yǎng)胎載胎，最終可形成腎虛血瘀之證。結合復發(fā)性流產(chǎn)MTHFR基因突變后所存在的血液高凝狀態(tài)、胎盤栓塞等這些病理變化，因而在中醫(yī)辨證均與血瘀證有密切的相關性。由此，推測腎虛血瘀可能參與復發(fā)性流產(chǎn)MTHFR基因突變發(fā)生發(fā)展過程。

本研究結果也顯示，復發(fā)性流產(chǎn)患者MTHFR基因TT型顯著高于對照組，提示MTHFR基因型中TT型與復發(fā)性流產(chǎn)密切相關。復發(fā)性流產(chǎn)患者TT型中，腎虛血瘀型顯著高于脾腎兩虛型、氣血兩虛型、腎虛血熱型、肝氣郁結型。提示復發(fā)性流產(chǎn)患者MTHFR基因型中TT型基因突變與腎虛血瘀型密切相關，提示腎虛血瘀可能是復發(fā)性流產(chǎn)MTHFR基因突變的基本病機之一。由于本次研究樣本量較少，結果可能存在一定的局限性，在今后工作中將擴大樣本數(shù)量做進一步深入研究。

[1]Aruna Meka，B Mohan Reddy.Recurrent Spontaneous Abortions：AnOverview ofGenetic andNon-Genetic Backgrounds[J].Int J Hum Genet,2006,6(2)：109-117.

[2]陳祥艷,馬大正,孫云,等.活血安胎方為主治療高D-二聚體復發(fā)性流產(chǎn)21例觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2016,51(6)：431.

[3]董素芹，杜欣瑩，劉學云.MTHFR基因多態(tài)性與不明原因習慣性流產(chǎn)中相關性分析[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2006，22（8）：500-501.

[4]張建平，林其德，李大金，等.復發(fā)性流產(chǎn)的診斷和治療[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2006,15(7)：481-492.

[5]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：253-258.

[6]肖承悰.中醫(yī)婦科臨床研究[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：170-174.

[7]王蘇梅，邱毅，高雪琴，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與妊娠相關疾病[J].國外醫(yī)學：婦產(chǎn)科學分冊，2004，31 (5)：303.

2017-02-20

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