泄化濁瘀方總皂苷對痛風及高尿酸血癥HK-2細胞有機陰離子轉運蛋白基因表達的影響*

魏 升 王建康 蔡旭東 鐘光輝

浙江省寧波市中醫院 浙江 寧波 315010

泄化濁瘀方總皂苷對痛風及高尿酸血癥HK-2細胞有機陰離子轉運蛋白基因表達的影響*

魏 升 王建康 蔡旭東 鐘光輝#

浙江省寧波市中醫院 浙江 寧波 315010

泄化濁瘀方 總皂苷 痛風 高尿酸血癥 HK-2細胞 有機陰離子轉運蛋白 基因表達

泄化濁瘀方臨床主要用于痛風及高尿酸血癥（痰瘀痹阻證）的治療，臨床療效確切。前期實驗及臨床研究表明[1]，其具有抑制黃嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促進尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，能明顯改善痛風及高尿酸血癥的臨床癥狀。本研究以有機陰離子轉運蛋白（OATs）尿酸鹽轉運蛋白為切入點，探討泄化濁瘀方治療高尿酸血癥（痰瘀痹阻證）的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品：泄化濁瘀方（土茯苓30g，萆薢、薏苡仁各15g，牛膝、澤蘭、澤瀉、當歸、桃仁、紅花各10g），組方由寧波市中醫院提供，藥物購于浙江省立同德醫院中藥房。經本實驗室提取、分離、純化，得泄化濁瘀方總皂苷，含量為62.24%。

1.2 主要試劑：苯溴馬隆片（德國赫曼大藥廠，批號：1600695）；逆轉錄試劑盒（Thermo，批號：00350176）；OAT1、OAT2、OAT3引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；熒光定量 PCR試劑盒（Promega，批號：0000163908）。

1.3 主要儀器：xCELLigence RTCA DP多功能實時無標記細胞分析儀［艾森生物（杭州）有限公司］；E-Plate 16檢測板［艾森生物（杭州）有限公司，批號：20160310］；7300型實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；TC-20細胞計數儀（Bio-Rad公司）。

1.4 xCELLigence RTCA DP實時細胞分析系統檢測泄化濁瘀方總皂苷對人腎小管上皮細胞（HK-2）細胞增殖的影響：取對數生長期的HK-2細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104個/ml，先在E-Plate板上每孔放入50μl培養基測基線，隨后加入100μl細胞懸液，置37℃、5%CO2培養箱中培養24h，xCELLigence RTCA DP實時細胞分析系統記錄細胞指數（CI）。精密稱取樣品泄化濁瘀方總皂苷，先用二甲基亞砜（DMSO）溶解，再用培養液稀釋，依次稀釋得500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml，DMSO終濃度≤1‰。設上述6個濃度皂苷組、正常對照組和1‰DMSO對照組，24h后加入上述不同濃度泄化濁瘀方總皂苷，每組3復孔，繼續培養96h，記錄CI。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測48h HK-2細胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表達：取對數生長期的HK-2細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/ml，接種于6孔板中，3復孔，每孔2.5ml，置37℃、5% CO2培養箱中培養24h后加藥，分成5組，即DMSO對照組（含1‰DMSO）、泄化濁瘀方總皂苷高劑量組（100μg/ml）、總皂苷中劑量組（50μg/ml）、總皂苷低劑量組（25μg/ ml）、苯溴馬隆組（100μg/ml），繼續培養48h，細胞用于提取RNA。用Trizol法提取總RNA，并測定總RNA的含量。逆轉錄采用10μl體系，加總RNA 0.5μg，隨機引物0.2μl，按照試劑盒說明進行逆轉錄反應操作。采用實時熒光定量PCR相對定量分析方法（2-ΔΔCt法）進行分析。

2 結果

2.1 xCELLigence RTCA DP實時細胞分析系統檢測泄化濁瘀方總皂苷對HK-2細胞增殖的影響：xCELLigence RTCA DP實時細胞分析系統連續記錄120h的CI值，正常對照組和1‰DMSO對照組的細胞增殖曲線相似，表明1‰濃度的DMSO對HK-2細胞無毒性；泄化濁瘀方總皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml 6個劑量組的細胞增殖曲線呈劑量相關。其中給藥后24h、48h、72h的CI值見表1，正常對照組和1‰DMSO對照組的24h、48h、72hCI值均無差異，表明1‰濃度的DMSO對HK-2細胞無毒性。總皂苷500和250μg/ml組的24h CI值均顯著低于正常對照組和1‰DMSO對照組（P＜0.05或P＜0.01）；總皂苷500、250、125、62.5、31.25μg/ml組的48h CI值與正常對照組和1‰DMSO對照組相比明顯降低（P＜0.01），并呈劑量相關；總皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml組的72h CI值均顯著低于正常對照組和1‰ DMSO對照組（P＜0.01）。72h IC50為16.9μg/ml。

2.2 實時熒光定量PCR法檢測48h HK-2細胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表達：由表2可見，與1‰DMSO對照組相比，泄化濁瘀方總皂苷100、50、25μg/ml對OAT1和OAT3基因表達有明顯的上調作用，對OAT2基因表達有明顯的下調作用（P＜0.01）。

表1 泄化濁瘀方總皂苷對HK-2細胞增殖的影響（±s）

表1 泄化濁瘀方總皂苷對HK-2細胞增殖的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與1‰DMSO對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組1‰ DMSO對照組總皂苷500μg/ml組總皂苷250μg/ml組總皂苷125μg/ml組總皂苷62.5μg/ml組總皂苷31.25μg/ml組總皂苷15.63μg/ml組例數3 3 3 3 3 3 3 3 24h CI 1.619±0.299 1.651±0.094 0.556±0.055**##1.107±0.159*#1.849±0.135 1.592±0.374 1.737±0.418 1.665±0.347 48h CI 2.570±0.160 2.665±0.143 0.303±0.049**##0.417±0.091**##0.549±0.049**##1.075±0.205**##1.342±0.148**##2.628±0.458 72h CI 3.875±0.420 4.023±0.263 0.059±0.014**##0.068±0.022**##0.056±0.017**##0.264±0.072**##1.115±0.108**##2.617±0.369**##

表2 泄化濁瘀方總皂苷對HK-2細胞OATS基因相對表達水平的影響（±s）

表2 泄化濁瘀方總皂苷對HK-2細胞OATS基因相對表達水平的影響（±s）

注：與1‰DMSO對照組比較，**P＜0.01。

組別1‰DMSO對照組總皂苷高劑量組總皂苷中劑量組總皂苷低劑量組苯溴馬隆組OAT3 1.000 23.358±0.408**14.271±0.151**10.880±0.396**21.539±0.227**OAT1 1.000 2.533±0.071**3.259±0.057**7.585±0.213**5.570±0.135**OAT2 1.000 0.743±0.047**0.555±0.020**0.396±0.013**2.648±0.037**

3 討論

筆者認為痛風的病因病機乃濁毒瘀滯使然，主張痛風病診斷一經明確，治療便應恪守泄化濁瘀方這一大法。臨床常以泄化濁瘀方為基礎方，取降泄濁毒與化瘀活血藥物進行配伍，如此可促進濁毒之泄化，解除瘀結之機轉，推陳致新，增強療效。本研究立足于總皂苷的研究，土茯苓[2]除了含有黃酮類成分外，皂苷是其主要成分之一。另外方中的萆薢[3]，也有報道[2]其含體皂苷，包括螺甾烷皂苷、孕甾烷昔、甾體苷元等。研究發現，泄化濁瘀方總皂苷100、50、25μg/ml對OAT1和OAT3基因表達有明顯的上調作用，對OAT2基因表達有明顯的下調作用（P＜0.01）。OATs功能主要是轉運體內內源性及外源性有機陰離子，尿酸是主要在腎小管通過OAT1和OAT3轉運的一種內緣性有機陰離子。OAT1和OAT3的腎臟中表達的下調，可以產生腎臟炎癥，從而減少腎臟的分泌和增加有機陰離子的積累。近年研究發現腎臟尿酸排泄減少與尿酸有機陰離子轉運體有關，OATs表達及功能缺陷可能為原發性高尿酸血癥重要的發病機制之一[4]。

藥物及其體內的代謝產物，通過與OAT1和OAT3相互作用產生毒性，其中大部分藥物是因為作為OAT1和OAT3的內、外源性底物，且相互之間存在競爭性抑制和非競爭性抑制，導致能夠產生毒性的物質蓄積于體內，從而對機體造成損害。研究發現，較長時間（48h、72h）中高濃度總皂苷組CI值均顯著低于正常對照組和1‰DMSO對照組（P＜0.01），對HK-2細胞產生一定毒性。兩者是否存在一定關聯，有待進一步證實。此外，研究發現泄化濁瘀方總皂苷可下調OAT2表達，影響OAT2活性是否能引起相應底物的藥效學與藥動學變化尚需要進一步研究。OAT2轉運不同藥物能力差別較大，臨床上可觀察到很多藥物影響OAT2的表達與活性，但其通過何種信號通路調控研究較少，仍需進一步深入探索。

[1]魏升，伍云洲，蔡旭東，等.中西醫結合治療痛風性腎病45例療效觀察[J].中國中醫藥科技，2016，23（6）：718-720.

[2]徐婷婷，承志凱，尹蓮，等.土茯苓抑制黃嘌呤氧化酶活性的物質基礎研究[J].中藥材，2012，35（4）：582-585.

[3]蘇筠霞.中藥“萆薢提取物”對尿酸性腎病保護作用的研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2014.

[4]Otani N，Ouchi M，Hayashi K，et al.Roles of organic anion transporters(OATs)in renal proximal tubules and their localization[J].Anat Sci Int，2016，92 (2)：200-206.

2017-03-10

浙江省中醫藥科技計劃項目泄化濁瘀方總皂苷對黃嘌呤氧化酶活性和OATs基因表達的影響，編號：2015ZB103

# 通訊作者：鐘光輝，E-mail：zgh20040712@126.com