高通量檢測(cè)技術(shù)對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良分子診斷的研究

陸靜 姚如恩★ 朱佳誼 王紀(jì)文 王劍

高通量檢測(cè)技術(shù)對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良分子診斷的研究

陸靜1姚如恩1★朱佳誼1王紀(jì)文2王劍1

目的利用高通量檢測(cè)技術(shù)對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD/BMD）患者進(jìn)行分子診斷，檢測(cè)DMD基因上各種類型的變異，評(píng)估組合的分子診斷技術(shù)應(yīng)用于假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的價(jià)值。方法對(duì)106例臨床疑似為假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者，利用CNVplex?技術(shù)檢測(cè)致病基因拷貝數(shù)變異，同時(shí)利用靶向捕獲及高通量測(cè)序檢測(cè)致病基因單核苷酸水平變異，對(duì)患者進(jìn)行精確的分子診斷。結(jié)果通過(guò)組合的高通量檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)到其中85例患者存在DMD基因的致病性變異，包括62例不同大小的外顯子缺失和重復(fù)，9例單核苷酸水平小缺失和重復(fù)，8例無(wú)義變異，2例錯(cuò)義變異和2例剪接位點(diǎn)變異。結(jié)論分子診斷對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者意義重大，組合的高通量檢測(cè)技術(shù)能檢測(cè)到不同類型的致病基因變異，精確的分子診斷結(jié)果對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的診斷和家系的遺傳咨詢有著重要意義。

高通量測(cè)序；分子診斷；基因突變

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良包括Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不 良（Duchenne muscular dystrophies，DMD）和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良（Becker muscular dystro?phies，BMD）。這2種疾病是原發(fā)于神經(jīng)肌肉組織的X連鎖隱性遺傳的疾病，其共同的分子基礎(chǔ)是抗肌萎縮蛋白（dystrophin）編碼基因DMD發(fā)生不同類型的變異［1］。隨著對(duì)DMD基因研究的深入，利用分子診斷結(jié)果作為DMD/BMD患者的確診依據(jù)，已經(jīng)越來(lái)越得到重視［2］。同時(shí)，DMD/BMD患者的分子診斷結(jié)果對(duì)家系其他相關(guān)成員的遺傳咨詢也有著重要的意義［3］。

作者單位：1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，分子診斷實(shí)驗(yàn)室，上海200126 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，神經(jīng)內(nèi)科，上海200126

DMD基因是人體最大的基因之一，位于X染色體p21.1區(qū)域，包含79個(gè)外顯子，覆蓋基因組范圍約2 Mb。DMD/BMD患者的變異類型大多為外顯子組水平的缺失和重復(fù)，占75%左右［4］，而單核苷酸水平的變異也可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，常規(guī)用于單基因遺傳病檢測(cè)的Sanger測(cè)序法，通常不作為DMD基因的分子診斷的首選方法。利用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiple liga?tion dependent probe amplification，MLPA）檢測(cè)患者DMD基因外顯子水平的拷貝數(shù)，被認(rèn)為是DMD/BMD患者分子診斷的有效手段［5］，但在未檢測(cè)到拷貝數(shù)變異的患者中，仍需繼續(xù)尋找單核苷酸水平的變異。因此，同時(shí)檢測(cè)外顯子水平的缺失和重復(fù)以及單核苷酸水平的變異是提高DMD/BMD患者分子診斷效率的的最佳手段。本研究擬利用基于MLPA技術(shù)改進(jìn)的外顯子拷貝數(shù)檢測(cè)方法CNVplex?，結(jié)合靶向基因捕獲高通量測(cè)序，檢測(cè)患者DMD基因，探討分子診斷結(jié)果對(duì)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的診斷和遺傳咨詢的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年2月至2016年10月在上海兒童醫(yī)學(xué)中心就診的疑似假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者106例，均為男性；采集患者及自愿進(jìn)行家系驗(yàn)證的患者母親外周血2 mL EDTA抗凝，4℃保存。使用QIAamp Blood DNA Mini kit核酸抽提試劑盒（Qiagen，德國(guó)）從外周血抽提所有樣本基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)質(zhì)量，均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。所有先證者或監(jiān)護(hù)人已經(jīng)簽署參加本研究的知情同意書(shū)。

1.2 CNVplex?檢測(cè)外顯子水平變異

采用天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司針對(duì)DMD基因的CNVplex?檢測(cè)試劑盒。連接反應(yīng)、連接產(chǎn)物多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物熒光毛細(xì)管電泳分離均參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用美國(guó)ABI公司ABI3130XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳，原始數(shù)據(jù)文件采用GeneMapper4.1進(jìn)行目標(biāo)峰高的數(shù)據(jù)讀取，進(jìn)而對(duì)樣本DMD基因區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析確定，尋找可能存在的外顯子水平缺失和重復(fù)。

1.3 FastTarget靶向富集及高通量測(cè)序

采用天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司設(shè)計(jì)的FastTarget高通量多重PCR擴(kuò)增富集技術(shù)對(duì)DMD基因啟動(dòng)子區(qū)、5′非編碼區(qū)（5′untranslated region，5′UTR）、編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、內(nèi)含子剪切點(diǎn)附近8 bp以及有文獻(xiàn)報(bào)道或數(shù)據(jù)庫(kù)記錄［6］的已知突變序列進(jìn)行富集，DNA質(zhì)量檢測(cè)、FastTarget目的區(qū)域富集、富集產(chǎn)物定量混合、PCR擴(kuò)增引入接頭和特異性標(biāo)簽、樣本文庫(kù)定量混合、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)均參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。富集產(chǎn)物采用高通量測(cè)序儀Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測(cè)序突變分析，任何一個(gè)目的片段的測(cè)序深度至少達(dá)到20倍。對(duì)DMD基因上檢測(cè)到的致病性單核苷酸變異，設(shè)計(jì)特異性的PCR擴(kuò)增引物，Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 家系成員檢測(cè)

在采集到的患者母親血樣的家系中，根據(jù)先證者檢測(cè)到的致病性變異的不同類型，選擇特異性的驗(yàn)證方法。若先證者的變異為外顯子缺失和重復(fù)，則用CNVplex?法對(duì)其母親外周血DNA進(jìn)行驗(yàn)證。若先證者的變異為單核苷酸水平的變異，則用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 106名患者分子診斷結(jié)果

在106名患者中，CNVplex?技術(shù)檢測(cè)到62名（51.7%）患者攜帶有DMD基因上的致病性拷貝數(shù)變異，其中包括54個(gè)缺失和8個(gè)重復(fù)，變異的大小從覆蓋1個(gè)外顯子到整個(gè)DMD基因不等，對(duì)所有的拷貝數(shù)變異進(jìn)行閱讀框判斷，其中12個(gè)為框內(nèi)突變，50個(gè)為框外突變，見(jiàn)圖1。通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)21名（17.5%）患者存在單核苷酸水平的變異，包括9例小缺失和重復(fù)，8例無(wú)義變異，2例錯(cuò)義變異和2例剪接位點(diǎn)變異，具體變異情況見(jiàn)表1，所有變異均通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

2.2 家系成員驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)14例有母親血樣的家系進(jìn)行致病變異驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)其中6名患者的變異為新發(fā)變異，其余8名患者的母親為與先證者相同變異的雜合攜帶者。

圖1 62名患者DMD基因外顯子水平的變異統(tǒng)計(jì)Figure 1 Eron level variants ofDMDgene in 62 patients

表1 21名檢測(cè)到DMD基因單核苷酸水平致病性變異Table 1 Single nucleotide level variants ofDMDgene in 21 patients

表2 14個(gè)家系驗(yàn)證DMD基因變異結(jié)果Table 2 Validation of variants ofDMDgene in 14 pedigrees

3 討論

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良是常見(jiàn)的累及骨骼肌的神經(jīng)肌肉疾病，DMD患者病情發(fā)展快，3歲左右無(wú)法獨(dú)立行走而需依靠輪椅代步，常死于心肌病或呼吸道并發(fā)癥，壽命一般不超過(guò)20歲［12］。BMD患者病情相對(duì)較輕，進(jìn)展緩慢，主要表現(xiàn)為四肢近端肌肉無(wú)力伴腓腸肌肥大。DMD/BMD發(fā)病率較高，約1∶5 000［13］，對(duì)該疾病進(jìn)行分子診斷，不僅有利于早期準(zhǔn)確地診斷疾病，且對(duì)家系相關(guān)成員的驗(yàn)證將為遺傳咨詢提供有力的證據(jù)［14］。DMD基因的致病性變異影響抗肌萎縮蛋白在橫紋肌組織中的表達(dá)，導(dǎo)致近端骨骼肌進(jìn)行性萎縮無(wú)力和腓腸肌代償性肥大。在患者中，DMD基因的外顯子缺失最常見(jiàn)，2個(gè)常見(jiàn)的熱點(diǎn)區(qū)域分別位于基因中央?yún)^(qū)域的第44～53號(hào)外顯子區(qū)域，以及靠近基因5′端的第2～20號(hào)外顯子區(qū)域［15］。除此之外，導(dǎo)致DMD/BMD發(fā)病的變異還包括外顯子的重復(fù)和單核苷酸水平的變異等。

本研究創(chuàng)新地利用基于MLPA技術(shù)改良的CNVplex?檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合FastTarget靶向富集及高通量測(cè)序技術(shù)，組合應(yīng)用于檢測(cè)患者DMD基因外顯子水平和單核苷酸水平的變異，試圖為患者的分子診斷提供準(zhǔn)確的依據(jù)。以往的研究認(rèn)為，MLPA是檢測(cè)DMD基因外顯子水平變異的最佳技術(shù)［16］，但CNVplex?檢測(cè)技術(shù)相較于 MLPA 在檢測(cè)探針合成上，更加省時(shí)省力。此外通過(guò)不同的熒光標(biāo)記策略，CNVplex?可以同時(shí)檢測(cè)基因組上更多位置的拷貝數(shù)信息［17］。

FastTarget技術(shù)針對(duì)目的區(qū)域設(shè)計(jì)多重PCR擴(kuò)增體系，對(duì)研究者感興趣的基因組區(qū)域捕獲富集并進(jìn)行高通量測(cè)序，該技術(shù)方法非常成熟，與Sanger測(cè)序法相比檢測(cè)更加快速、操作簡(jiǎn)單，與其他高通量測(cè)序建庫(kù)方法相比省去了復(fù)雜的建庫(kù)過(guò)程［18］。本研究利用這2種檢測(cè)方法的組合，在106名疑似假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者中，成功檢測(cè)到85個(gè)致病性變異，其中外顯子水平的變異最小僅覆蓋單個(gè)外顯子，最大覆蓋整個(gè)DMD基因區(qū)域；單核苷酸水平的變異在運(yùn)用高通量測(cè)序方法檢出后，均通過(guò)Sanger測(cè)序法驗(yàn)證。其中9例單核苷酸水平的小缺失和重復(fù)以及8例無(wú)義變異均會(huì)因?yàn)榻K止密碼的異常編碼而造成截短的蛋白，引起DMD的發(fā)生。2例剪接位點(diǎn)變異均未被人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Gene Mutation Database，HGMD）和 LOVD（Leiden Open Variation Database）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，但經(jīng)斷裂位點(diǎn)功能預(yù)測(cè)軟件分析（NNSPLICE v9.0）均可能導(dǎo)致異常的RNA剪接。本研究中發(fā)現(xiàn)2例錯(cuò)義變異，其中p.Leu116Pro被HGMD 收錄［2］，而 p.Gln2937Arg為首次發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義變異。雖然在之前的DMD/BMD患者相關(guān)分子診斷研究中［19］，錯(cuò)義變異的檢出率相對(duì)較低，但Juan?Mateu等［20］研究中認(rèn)為錯(cuò)義變異也可能導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白的異常剪接，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此必須通過(guò)相關(guān)功能試驗(yàn)來(lái)判斷變異是否具有致病性。本研究所采用的組合檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)成本和報(bào)告周期更加符合臨床應(yīng)用的情況下，達(dá)到了與以往研究相同水平的檢測(cè)陽(yáng)性率（80.2%）［4，21］，進(jìn)一步證實(shí)了分子診斷技術(shù)在假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良患者診斷中的作用。

Monaco等［22］提出的針對(duì)DMD基因的“閱讀框架假說(shuō)”（reading frame rule）認(rèn)為癥狀較嚴(yán)重的DMD患者大多數(shù)是由于框外突變（out of frame）所致，而癥狀較輕的BMD患者則是由于不影響閱讀框的框內(nèi)突變（in frame）導(dǎo)致。約90%DMD/BMD患者符合閱讀框規(guī)則，因此基于分子診斷結(jié)果判斷閱讀框，從而確定患者為DMD或BMD，可以在患者出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀前明確診斷，早期干預(yù)，提高生活質(zhì)量［23］。本研究中12例框內(nèi)突變患者，后期臨床均確診為BMD，與基于閱讀框判斷的疾病類型相符。患者在檢測(cè)到DMD基因致病性變異后，應(yīng)對(duì)家系相關(guān)成員進(jìn)行攜帶者驗(yàn)證，為遺傳咨詢提供重要線索，本研究發(fā)現(xiàn)8名先證者母親為DMD基因致病變異雜合攜帶者。在本研究中仍有21名患者并未通過(guò)這2種高通量檢測(cè)技術(shù)尋找到DMD基因的致病性變異，可對(duì)患者外周血RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否正常，并進(jìn)一步尋找內(nèi)含子中可能存在的致病性變異［4］。此外，也需仔細(xì)評(píng)估患者臨床表型，判斷患者是否為肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（limb girdle muscular dystro?phy，LGMD）、Emery?Dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Em?ery?Dreifuss muscular dystrophy，EDMD）或其他肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，并對(duì)其進(jìn)行鑒別診斷［24］。

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良最傳統(tǒng)的治療方法是運(yùn)用糖皮質(zhì)激素治療配合康復(fù)理療。糖皮質(zhì)激素可以延緩肌力及肌肉功能的衰退，但長(zhǎng)時(shí)間使用糖皮質(zhì)激素會(huì)出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，并且會(huì)出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素耐藥情況［25］。基因替代治療有望成為最有效的DMD/BMD治療方法，首個(gè)批準(zhǔn)上市的基因藥物deflazacort以外顯子跳躍為分子基礎(chǔ)，可以成功治療第51號(hào)外顯子缺失的患者。德州大學(xué)最新研究利用CRISPR?Cpf1修復(fù)老鼠模型和人類細(xì)胞中DMD基因的缺陷，試圖達(dá)到治療疾病的目的，為DMD/BMD患者的分子治療提供了新思路［26］。

準(zhǔn)確評(píng)估每個(gè)患者所攜帶的DMD基因致病性變異，為其尋找最恰當(dāng)?shù)姆肿又委熓侄翁峁┝死碚撘罁?jù)。

綜上所述，利用高通量檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)DMD基因外顯子水平的變異和單核苷酸水平的變異，是對(duì)DMD/BMD患者進(jìn)行分子診斷的最佳方法。利用CNVplex?和靶向富集高通量測(cè)序技術(shù)得到的結(jié)果，可以幫助早期診斷為DMD/BMD的患者在一定程度上確診疾病類型，也為患者尋找可行的個(gè)體化治療方案和對(duì)患者家系成員的驗(yàn)證及之后的遺傳咨詢提供了可靠的依據(jù)。

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Analysis of molecular diagnosis in DMD/BMD patients using high throughput detection technique

LU Jing1，YAO Ruen1★，ZHU Jiayi1，WANG Jiwen2，WANG Jian1
（1.Molecular Diagnostic Laboratory，Shanghai Children's Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，200126；2.Department of Neurology，Shanghai Children's Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，200126）

ObjectiveTo perform molecular diagnosis for patients suspected with dystrophinopathy,and to detect pathogenic variants onDMDgene with the aim of evaluation of molecular diagnosis in those patients.MethodCNVplex?technology and targeted capture combined with high throughput sequencing were used to detect variants of exon level and single nucleotide level respectively in 106 suspected dystrophinopathy patients.Results85 pathogenic variants were detected through combined detection,including 62 exon deletion/duplication,9 nucleotide insertion/deletion,8 nonsense variants,2 missense variants and 2 splicing variants.ConclusionMolecular diagnosis is important for patients suspected with dystrophinopathy and combined testing strategy manifested better efficiency.The accurate results of molecular diagnosis offers great help in both clinical diagnosis and family genetic counseling.

High throughput sequencing;Molecular diagnosis;Genetic variants

★通訊作者：姚如恩，E?mail：yaoruen@126.com