枸橘苷對胃癌細胞抑制作用及其機制研究

張 韡， 李 忠

(南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院， 河南 南陽 473004)

枸橘苷對胃癌細胞抑制作用及其機制研究

張 韡， 李 忠△

(南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院， 河南 南陽 473004)

目的： 探究枸橘苷對AGS胃癌細胞抑制作用及其機制。方法: MTT實驗檢測枸橘苷對AGS細胞活力的影響；流式細胞術(shù)分析細胞周期分布以及細胞凋亡；細胞核染色分析AGS細胞在枸橘苷處理之后的形態(tài)學變化；Western blot檢測枸橘苷對AGS細胞中外源性凋亡通路相關(guān)蛋白 FasL、caspase-8、caspase-3和PARP，以及內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-xL、Bax和caspase-9蛋白水平的影響。結(jié)果: MTT實驗表明枸橘苷抑制AGS胃癌細胞活力，并且呈時間、劑量依賴性(P<0.05)；流式細胞術(shù)分析結(jié)果表明枸橘苷使細胞停滯在G1期，凋亡數(shù)量增加(P<0.05);核染色結(jié)果說明，與對照組相比，150 μmol/L枸橘苷處理后細胞核明顯濃縮， 細胞凋亡數(shù)量增加；Western blot實驗表明枸橘苷上調(diào)FasL，激活caspase-8和caspase-3，促使活化的caspase-3底物PARP切割(P<0.05)，而對線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)源性凋亡通路相關(guān)蛋白沒有影響。結(jié)論: 枸橘苷通過激活外源性凋亡通路促使AGs細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床上可能成為治療胃癌的新型藥物。

枸橘苷； 胃癌細胞； 細胞凋亡

胃癌是全球第二大與癌癥相關(guān)的死亡率最高的疾病[1]。AGS細胞是一種人胃癌細胞系，可以表達野生型p53[2]，可用于多種抗腫瘤藥物對于胃癌細胞的作用研究。而野生型p53是腫瘤抑制蛋白，可抑制腫瘤細胞增殖，調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期與凋亡[3]。

近年來天然產(chǎn)物在控制腫瘤方面?zhèn)涫荜P(guān)注。已有報道多種蔬菜和水果含有豐富的黃酮類成分與低癌癥發(fā)病率相關(guān)[4-5]。柑橘類水果含有豐富的黃酮類化合物，例如橘皮苷、川陳皮素、枸橘苷等[6-8]。枸橘苷是二氫黃酮類類化合物，味道苦澀，具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤的作用[9-11]。然而很少研究報道橘皮苷對胃癌的作用及作用機制。

材料和方法

1主要試劑

噻唑藍溴化四唑(MTT)購自上海日初生物技術(shù)公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自Bio Vision；所有的抗體及 II 抗購自Cell Signaling Technology;枸橘苷購自上海同田生物技術(shù)公司。

2細胞來源以及培養(yǎng)

AGS細胞購自中國生命科學院細胞資源中心，培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代時用0.25%的胰酶處理。

3方法

3.1MTT實驗 細胞活力用MTT實驗測定。AGS細胞培養(yǎng)在96孔板中，接種密度為1×104，接種24 h，并且設(shè)置6個復孔。之后分2組處理。第1組用不同濃度枸橘苷處理細胞48 h，將枸橘苷溶解于DMSO中，濃度分別為0(對照組，control group)、50、100和150 μmol/L。另外一組用100 μmol/L枸橘苷處理AGS細胞不同時間，分別為24 h、48 h和72 h。用PBS洗滌細胞之后，用20 μL的5 g/L MTT 37 ℃處理細胞4 h。棄掉MTT之后，每孔加入100 μL DMSO溶液。96孔板在室溫下溫和搖蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光度值。

3.2細胞周期檢測實驗 枸橘苷處理AGS細胞24 h之后，PBS洗滌細胞，胰酶消化，收集細胞于流式管中。用預冷的70%的乙醇在-20 ℃固定過夜。離心之后，PBS洗滌細胞。加入500 μL PBS (含有50 mg/L PI、100 mg/L RNase A和 0.2% Triton X-100)，4 ℃避光孵育30 min。采取標準程序用流式細胞儀檢測，計數(shù)(2～3)×104個細胞，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

3.3凋亡檢測 使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明檢測細胞凋亡，然后用流式細胞術(shù)分析。不同濃度(0、50和150 μmol/L)枸橘苷處理AGS細胞24 h。之后用PBS洗滌細胞，胰蛋白酶消化細胞并且離心(5 min, 4 ℃, 1 000 r/min)。細胞重懸于200 μL PBS中。再次離心，重懸于500 μL 1×Annexin V Binding Buffer。然后將100 μL細胞與5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在室溫下孵育15 min。之后用FACScan流式分析儀分析細胞凋亡情況。

3.4Western bolt實驗 將AGS胃癌細胞中培養(yǎng)基棄掉，用PBS洗2次。每個小皿加入80 μL裂解液，在冰上裂解20 min。刮蛋白，離心(13 min, 4 ℃, 13 000 r/min)收集總蛋白裂解液。BCA工作液根據(jù)BSA(0.5 g/L)制備標準曲線，檢測不同處理細胞蛋白濃度。制備上樣蛋白。等量蛋白總量在8% SDS-PAGE中分離。之后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育anti-FasL、anti-caspase-8、anti-caspase-3、anti-PARP、anti-Bak、anti-caspase-9、anti-Bax、anti-Bcl-xL和anti-β-actin抗體，放在4 ℃，過夜。PBS洗3次，每次5min。孵育相應(yīng)的 II 抗。PBS洗3次，每次10 min，在膜上均勻覆蓋ECL化學發(fā)光液在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

3.5細胞核染色 不同濃度(0、50和150 μmol/L)枸橘苷處理AGS細胞24 h之后，PBS洗滌細胞3次。之后細胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌細胞3次。在常溫避光下，DAPI染色10 min，PBS洗滌細胞3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察拍照。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。所有的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差(mean±SD)。計量資料行one-way ANOVA檢驗，組間的兩兩比較行LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1枸橘苷抑制AGS細胞的活力

MTT實驗結(jié)果表明枸橘苷可顯著抑制AGS細胞活力，并且具有時間和劑量依賴關(guān)系(P<0.01)，見圖1。

2枸橘苷對人胃癌AGS細胞的細胞周期及凋亡的影響

流式細胞術(shù)分析不同濃度枸橘苷處理AGS細胞之后細胞周期分布和凋亡情況。當枸橘苷濃度為50和150 μmol/L時，AGS細胞在G1分布分別增加到10.61%和21.88%。Annexin V-FITC/PI分析細胞凋亡分布情況，用0、50和150 μmol/L枸橘苷處理AGS細胞之后，細胞總凋亡率從2.6%增加到14.5%和27.2%，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。DAPI染色表明隨著枸橘苷濃度增加，AGS細胞形態(tài)改變，凋亡數(shù)量增加，見圖2。

Figure 1. The effect of poncirin on AGS cell viability measured by MTT assay. A： the effect of different concentrations of poncirin for 48 h on AGS cell viability; B： the effect of 100 μmol/L poncirin for different time on AGS cell viability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs24 h.

圖1MTT實驗分析枸橘苷對AGS細胞活力的影響

3枸橘苷對胃癌細胞中FasL依賴的外源性凋亡途徑影響

為了檢測FasL是否參與枸橘苷誘發(fā)的配體激發(fā)外源性凋亡途徑，我們采用Western blot法檢測FasL的表達。結(jié)果顯示枸橘苷呈劑量依賴性地上調(diào)FasL和Fas的表達(P<0.05)，且枸橘苷能夠以劑量依賴性方式激活FasL的下游靶蛋白caspase-8、caspase-3和PARP的切割，見圖3。

4枸橘苷對胃癌細胞中線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑影響

為了檢測枸橘苷是否對內(nèi)源性線粒體介導的凋亡通路有作用，用Western blot法分析枸橘苷對線粒體相關(guān)凋亡蛋白影響。與對照組相比，50和150 μmol/L枸橘苷處理細胞之后Bax/Bcl-xL比值沒有變化，Bak蛋白水平也沒有變化，同時與線粒體凋亡途經(jīng)相關(guān)的凋亡蛋白caspase-9沒有激活，見圖4。

討 論

幾千年來，柑橘類植物在亞洲被廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)藥[12]。柑橘類果實中含有豐富的黃酮類化合物，例如橘皮苷、川陳皮素、枸橘苷等通過抑制細胞周期，促進凋亡、自噬、焦亡等途經(jīng)抑制不同的腫瘤細胞系[13-15]。我們的研究闡明枸橘苷誘導AGS胃癌細胞凋亡的機制。我們的研究主要集中研究凋亡的2條途經(jīng)(內(nèi)源性凋亡途經(jīng)和外源性凋亡途經(jīng))。首先，枸橘苷能夠以劑量和時間依賴性方式抑制AGS腫瘤細胞增殖，以劑量依賴性方式誘導細胞凋亡；其次，枸橘苷對于AGS細胞的抑制作用涉及caspase的激活。枸橘苷誘導細胞死亡是通過上調(diào)FasL外源性凋亡途經(jīng)，但是不依賴于線粒體介導的凋亡途經(jīng)。

凋亡過程在維持機體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。凋亡涉及一系列的生物化學過程導致細胞典型的形態(tài)學改變以及細胞死亡，細胞凋亡涉及的分子信號途經(jīng)有外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導的凋亡途徑[16-18]。細胞活性實驗表明150 μmol/L枸橘苷顯著抑制AGS胃癌細胞增殖。近年來有研究表明導致多種細胞系凋亡是細胞周期被改變所致[19-20]。我們研究發(fā)現(xiàn)枸橘苷處理之后AGS細胞被阻滯于G1期，而在S期和G2/M期的細胞比例降低。Annexin V-PI凋亡檢測表明枸橘苷以劑量依賴性方式增加總凋亡細胞群。這些研究表明枸橘苷使AGS腫瘤細胞阻滯于G1期，促進細胞凋亡。

Western blot結(jié)果顯示通過上調(diào)FasL蛋白表達，相繼激活caspase-8和caspase-3，切割PARP，而切割的PARP是活化caspase-3的底物蛋白[21]。這些結(jié)果說明在AGS細胞中枸橘苷誘導的凋亡細胞死亡是Fas死亡受體介導的隨后caspase依賴的外源性凋亡途徑。而我們實驗結(jié)果還表明枸橘苷處理AGS細胞之后線粒體依賴的凋亡通路并沒有變化。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，過表達此蛋白會抑制內(nèi)源性凋亡途徑；Bax是促凋亡蛋白，過表達之后會促進內(nèi)源性凋亡通路[22]。枸橘苷處理細胞之后并沒有發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白與Bax蛋白變化，Bcl-xL/Bax比值也沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白caspase-9在枸橘苷處理AGS胃癌細胞之后沒有變化。這些結(jié)果表明線粒體誘導凋亡通路并不參與枸橘苷誘導的AGS細胞凋亡。

Figure 2. Effect of poncirin on cell cycle distribution and apoptosis of AGS cells. The cells were incubated with different concentrations of poncirin for 24 h. A: representative images and statistical analysis of cell cycle distribution; B: representative images and statistical analysis of cell apoptosis; C: DAPI staining showed nuclear condensation in AGS cells, as indicated by white arrows. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖2枸橘苷對AGS細胞的細胞周期分布及凋亡的影響

Figure 3. The effects of poncirin on Fas ligand (FasL)-mediated extrinsic apoptosis pathway in AGS cells determined by Western blot analysis. The cells were incubated with different concentrations (0, 50, 100 and 150 μmol/L) of poncirin for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3Westernblot檢測不同濃度枸橘苷對AGS胃癌細胞中FasL介導的外源性凋亡途徑的影響

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Figure 4. The effects of poncirin on intrinsic apoptosis pathway in AGS cells determined by Western blot analysis. The cells were incubated with different concentrations (0, 50 and 150 μmol/L) of poncirin for 48 h. Mean±SD.n=3.

圖4Westernblot檢測不同濃度枸橘苷對AGS胃癌細胞中內(nèi)源性凋亡途徑的影響

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Inhibitory effect of poncirin on viability of gastric cancer cells and underlying mechanism

ZHANG Wei, LI Zhong

(Zhang Zhongjing College of Traditional Chinese Medicine, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China. E-mail: lizhong7011@sina.com)

AIM: To explore the effect of poncirin on the growth of AGS gastric cancer cells and the underlying mechanism.METHODS: The effect of poncirin on AGS cell viability was measure by MTT assay. The cell cycle distribution and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. Nuclear staining with DAPI was used to reflect the morphological change of the AGS cells treated with poncirin. The protein levels of extrinsic apoptosis pathway-related proteins such as FasL, caspase-8, caspase-3 and PARP， and mitochondria-mediated intrinsic apoptosis pathway-associated proteins such as Bak, Bcl-xL, Bax and caspase-9 were determined by Western blot.RESULTS: Poncirin inhibited the viability of AGS gastric cancer cells in a time- and concentration-dependent manner (P<0.05). Poncirin induced accumulation of G1DNA content and significantly increased total apoptosis in the AGS cells. Nuclear staining showed a dose-dependent increase in the number of apoptotic cells after treated with poncirin.The protein level of FasL was upregulated in a dose-dependent manner by treatment with poncirin. Poncirin significantly activated caspase-8 and caspase-3. Moreover, poncirin significantly induced the cleavage of PARP in a dose-dependent manner (P<0.05). In addition, the protein levels of Bcl-xL， Bax and Bak were unchanged after treated with different doses of poncirin. Furthermore, caspase-9 was not activated by poncirin treatment in the AGS cells.CONCLUSION: Poncirin has the anti-cancer effect via extrinsic apoptosis pathway to inhibit the growth of AGS gastric cancer cells, possibly making it a therapeutic agent for human gastric cancer treatment.

Poncirin; Gastric cancer cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1637- 06

2017- 05- 15 [

] 2017- 07- 20

R735.2； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.017

△通訊作者 Tel: 0377-62071303； E-mail： lizhong7011@sina.com