改良配制方法下青霉素鈉皮試液穩定性考察

宛霞　潘靜　肖偉

[摘要] 目的 考察青霉素鈉皮試液在2～8℃環境下放置4 h后其有關物質的變化，用于指導注射用青霉素鈉的使用。 方法 采用高效液相法對青霉素鈉樣品進行分析。使用Red Classical C18色譜柱（5 μm，150.0 mm×4.6 mm），磷酸鹽緩沖液、甲醇和乙腈為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，柱溫34℃，進樣量20 μL。 結果 經過酸堿破壞后的青霉素溶液雜質含量會升高，并產生新的雜質，而放置4 h后的青霉素溶液則未產生新的雜質。青霉素鈉樣品在放置前后其溶液中雜質F含量沒有明顯變化，雜質A、B、C、D、E有一定的變化，但雜質總和未超過對照溶液主峰面積。 結論 改良配制方法簡化了配制流程，青霉素鈉皮試液2～8℃環境下放置4 h過程中有關物質含量有所上升，增加了假陽性發生的可能，建議盡量在較短時間內使用。

[關鍵詞] 青霉素鈉；皮試液；穩定性；有關物質

[中圖分類號] R927.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of related substance of Penicillin Sodium skin test solution after keeping at 2-8℃ environment for 4 h， in order to guide the use of Penicillin Sodium for injection. Methods High performance liquid chromatography was used to analyze the samples of Penicillin Sodium. The Red Classical C18 chromatographic column （5 μm， 150.0 mm×4.6 mm） was adopted， phosphate buffer， methanol and acetonitrile were used as mobile phase， with the flow rate of 1.0 mL/min. The detecting wave length was set at 225 nm， the column temperature was 34℃ and the injection volume was 20 μL. Results The content of impurities in Penicillin solution would increase after acid or base destruction and the new impurities would appear， while there were no new impurities appeared in the Penicillin solution after storage for 4 h. The content of impurity F in skin test solution of Penicillin Sodium samples had no significant changes before and after storage， while the contents of impurities A， B， C， D， E had certain changes， but the total content of impurities was not more than the corresponding main area of the control solution. Conclusion The modified preparation method simplifies the preparation process. The content of related substance of Penicillin Sodium skin test solution will increase after keeping for 4 h at 2-8℃， which increase the possibility of false positive result， therefore， Penicillin Sodium should be used during shorter time.

[Key words] Penicillin Sodium； Skin test solution； Stability， Related substance

青霉素類藥物屬于β-內酰胺類抗生素，對多種細菌感染具有很好的治療效果，在臨床上常作為首選藥物[1-3]，其降解產物可與蛋白質結合引起變態反應，臨床使用前患者需完善皮試，減少藥物變態反應的發生，青霉素皮試液的配制方法較多[4-5]，南京醫科大學附屬兒童醫院目前使用的是青霉素皮試液改良配制方法，即將青霉素皮試液放置成規定濃度后，在2～8℃條件下儲存，在4 h內備用。該方法克服了傳統配制過程“三抽、三混勻、二推”的復雜操作，但是儲存過程是否可以保證皮試液不發生降解，避免因雜質含量上升引起陽性結果是臨床護理工作關心的重點[6-7]。目前，已有研究提示青霉素皮試液在室溫下放置4 h后含量不會降低[8-9]，但是未報道其降解產物變化情況。本研究希望參照2015年版《中國藥典》[10]596～599有關要求對于2～8℃環境下放置4 h后的降解產物進行含量分析，進一步保證皮試結果準確性和臨床使用安全性。2015年版《中國藥典》[10]提示注射用青霉素鈉中主要有關物質包括2-羥基-5、5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、2-[（苯乙酰基）氨基]-乙酸、青霉酸二聚體等，在紫外225 nm處均有吸收，故本研究采用高效液相等度洗脫的方法進行檢測。endprint

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（UltiMate 3000高效液相色譜泵，UltiMate 3000紫外檢測器，Chromeleon色譜數據工作站），美國Dionex公司；Newclassic電子天平，南京科翔儀器設備有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器有限公司；BCD-539WL型冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.2 試藥

青霉素系統適應性對照品，中國藥品生物制品檢定所；注射用青霉素鈉，山東魯抗醫藥股份有限公司（批號：B150610）；磷酸二氫鉀（分析純），南京化學試劑有限公司；磷酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；鹽酸（分析純），西隴化工股份有限公司；甲醇（色譜級），美國Tedia；乙腈（色譜純），美國Tedia。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件及系統適應性 采用Red Classical C18色譜柱（5 μm，150.0 mm×4.6 mm），參照《中國藥典》（2015版）[10]青霉素鈉有關物質檢查項下，以磷酸鹽緩沖液-甲醇（72∶14）為流動相A，乙腈為流動相B。流動相A∶流動相B=86.5∶13.5，流速為1.0 mL/min，柱溫34℃，進樣量為20 μL，波長為225 nm。在此色譜條件下對系統適應性對照品進行檢測，記錄色譜圖。

1.3.2 流動相與樣品配制 流動相A：稱取10.6 g磷酸二氫鉀，加水至1000 mL，調節pH至3.4，得到磷酸緩沖液。取磷酸緩沖液720 mL，甲醇140 mL，混勻后超聲，得到流動相A。取超聲過的乙腈作為流動相B。青霉素鈉樣品：精密稱取青霉素鈉0.04 g于10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。青霉素鈉放置樣品：將青霉素鈉樣品置于2～8℃冰箱放置4 h后取出。酸破壞樣品：精密稱取0.04 g青霉素于10 mL容量瓶中，適量水溶解，加50 μL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，靜置10 min后，加等量0.1 mol/L的NaOH溶液中和，并加水稀釋至刻度線。堿破壞樣品：精密稱取0.04 g青霉素鈉樣品于10 mL容量瓶中，適量水溶解，加50 μL 0.1 mol/L的NaOH溶液，靜置10 min，加等量0.1 mol/L的鹽酸溶液，加水稀釋至刻度線。對照溶液：取1 mL青霉素鈉樣品溶液于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 19.0進行統計學檢驗，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 色譜條件及系統適應性

青霉素主成分保留時間在23.70 min左右，理論塔板數不小于4000，分離度良好。如圖1所示，將雜質A、B、C、D、E、F所對應的峰面積分別與主峰面積相比，得到比值，并對放置前的樣品作對比（按《中國藥典》[10]規定，所有雜質峰面積的總和不能超過對照溶液的主峰面積），結果顯示，有關物質A、B、C、D、E、F均有較好的分離度。

2.2 有關物質變化

酸破壞樣品色譜圖見圖2，青霉素鈉樣品經過酸破壞后雜質B的含量明顯升高，同時還會出現一個新的雜質G；堿破壞樣品色譜圖見圖3，經過堿破壞后雜質B、D含量明顯增加，并且還會出現新的雜質H。有關物質的變化情況見表1。而青霉素鈉樣品雜質峰總面積約為1.2，樣品放置后的雜質峰總面積約為1.3，均小于對照溶液主峰面積10.8，均未超過《中國藥典》[10]中對青霉素鈉有關物質項下的規定。

3 討論

黃春蓮等[11]曾經報道過青霉素鈉皮試液在靜置4 h后濃度沒有明顯改變，得出該改良配制方法下的皮試液穩定性好的結論。但是相關雜質是引起青霉素使用者過敏的主要原因，也是引起皮試液假陽性的因素[12-13]，所以基于雜質變化情況的研究結果可信度會更高。

本研究利用HPLC法檢測了皮試液有關物質變化的情況，關于皮試液穩定性的研究結論更可靠。配制液靜置4 h后，雜質A、B、C、D、E有明顯變化，而雜質F無顯著性變化。根據《中國藥典》[10]青霉素鈉有關物質檢查項，雜質總和未超過對照溶液主峰面積，說明溶液放置4 h后，某些雜質含量會升高，但是暫未超過藥典標準，表明青霉素鈉溶液放置4 h后仍未變質。因此，改良配制方法簡化了配制流程，但在靜置過程中有關物質含量有所上升，潛在增加假陽性發生的比率，需盡量在較短的時間內使用。

本研究改進了青霉素有關物質檢測的色譜條件，分離程度更好，檢測效能更高。王潤彪等[14]對青霉素有關物質檢測時采用梯度洗脫法，而在實際操作過程中發現梯度洗脫基線不穩定，某些色譜峰也難以得到很好的分離，而采用等度洗脫的方法時，其圖譜能達到分析要求。使用磷酸鹽緩沖液作為流動相時，由于緩沖液含量過高，容易堵塞液相管路，在測定過程中應注意經常沖洗。

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（收稿日期：2017-02-16 本文編輯：張瑜杰）endprint