含量測(cè)定結(jié)合HPLC指紋圖譜用于香加皮質(zhì)量評(píng)價(jià)

李瑞雪　吳飛　張繼全

[摘要] 目的 建立總皂苷含量測(cè)定方法和HPLC指紋圖譜分析方法，對(duì)不同產(chǎn)地香加皮藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。 方法 采用紫外可見(jiàn)分光光度法，以杠柳苷C（PSA）為對(duì)照品，建立香加皮藥材中總皂苷的含量測(cè)定方法；同時(shí)建立香加皮藥材HPLC指紋圖譜。對(duì)12批不同產(chǎn)地的香加皮中總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定，建立指紋圖譜，計(jì)算相似度，采用SPSS軟件對(duì)兩類(lèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。 結(jié)果 以5%香草醛-冰醋酸顯色體系，檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm，12批藥材中總皂苷含量在170～250 mg/g之間，差異較大；采用Capcell Pak C18色譜柱，流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)263 nm，香加皮藥材指紋圖譜共標(biāo)定25個(gè)共有峰，除1批樣品外，其余樣品相似度均在0.9以上。對(duì)皂苷含量及相似度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，12批香加皮主要分為兩類(lèi)，高含量組和低含量組。 結(jié)論 建立的含量測(cè)定結(jié)合指紋圖譜分析方法可以更好地用于香加皮的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[關(guān)鍵詞] 香加皮；紫外分光光度法；HPLC指紋圖譜；質(zhì)量評(píng)價(jià)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To set up a simple and accurate method for the determination and evaluatation of Cortex Periplocae by UV-visible sepctrophotomery and HPLC fingerprint. Methods Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae with periploside C （PSA） as the reference substance by UV-visible sepctrophotomery， meanwhile establish HPLC fingerprint and calculate the similarity. All data was analyzed by the SPSS statistical software. Results Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae by 5% vanillin-glacial acetic acid with the detection wavelength at 480 nm. There was a significant difference in contents that ranged from 170 to 250 mg/g. HPLC analysis was performed on a Capcell Pak C18 column with the detection wavelength at 263 nm. The mobile phase was water containing 0.2% formic acid and acetonitrile in the gradient mode. 25 pesks were selected as the common peaks and the similarities were above 0.9 besides batch 7. Based on the results of quantification and fingerprint analysis， the results indicated that the 12 batches cortex periplocae divided into 2 classes： high and low content. Conclusion The established HPLC fingerprint and quantitative analysis methods can be used efficiently in the quality control of Cortex Periplocae.

[Key words] Cortex Periplocae； UV sepctrophotomery； HPLC fingerprint； Quality assessment

香加皮（Cortex Periplocae）為蘿摩科植物杠柳（Periploca sepium Bunge）的根皮，又被稱(chēng)為北五加皮、杠柳皮或者香五加皮。最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，《中國(guó)藥典》也均有收載，其功能祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨，用于心悸氣短、下肢水腫、風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟[2]。

市場(chǎng)上香加皮與南五加皮混用情況比較嚴(yán)重，給臨床用藥帶來(lái)困擾[3-4]?！吨袊?guó)藥典》2015年版中以4-甲氧基水楊醛作為藥材的含量控制指標(biāo)[5]，也不能滿(mǎn)足當(dāng)前以C21甾體苷類(lèi)成分為目標(biāo)[6-8]的一些新藥開(kāi)發(fā)研究需求。分別采用紫外分光光度法[9-14]和指紋圖譜方法[15-21]用于評(píng)價(jià)藥材的技術(shù)應(yīng)用甚廣，而指紋圖譜結(jié)合定量分析[22-25]更能綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。本研究建立紫外分光光度法測(cè)定總皂苷含量結(jié)合高效液相色譜指紋圖譜分析方法用于評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地香加皮藥材的質(zhì)量，為香加皮藥材的規(guī)范種植和新藥開(kāi)發(fā)提供技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1800型紫外分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Capcell pak C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，資生堂（中國(guó)）投資有限公司]；TE-214S型分析天平（0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），XP-205型分析天平（0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司），SK5200H超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），KA-1000型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），Milli-Q型超純水制備儀（密理博中國(guó)有限公司）。endprint

中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版，藥典委員會(huì)），SPSS軟件（22.0版）。

1.2 試劑

杠柳苷C（PSA）、杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）、杠柳苷（WJ32）對(duì)照品（批號(hào)均為20160316，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所提供，純度分別為98.16%、98.49%、98.09%、99.04%、98.13%、98.77%、95.86%）；香草醛（批號(hào)：20150611，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?，蒸餾水（自制）。

1.3 藥材

12批香加皮藥材飲片購(gòu)于飲片公司，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所趙維民研究員鑒定，12批藥材均為蘿摩科植物杠柳的干燥根皮。藥材詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測(cè)定總皂苷

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取PSA對(duì)照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇溶解制得濃度為1.0256 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取香加皮藥材最細(xì)粉1.0 g，加入75%乙醇25 mL，超聲30 min（53 kHz），將提取液離心（5000 r/min，10 min）取上清作為供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定方法 精密移取供試品溶液于具塞試管中，揮干溶劑，精密加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.6 mL高氯酸，搖勻，密塞，90℃水浴保溫50 min，冰水浴10 min，加冰醋酸至10 mL，搖勻，以空白試劑為對(duì)照，480 nm下測(cè)定吸光度。

2.1.4 方法學(xué)考察 以PSA含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=4.73267X+0.1156，r=0.9995，表明PSA在0.05128～0.41024 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)中，吸光度RSD為0.022%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，藥材總皂苷的平均含量為148.73 mg/g，RSD=2.5%，表明方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，120 min內(nèi)RSD=1.2%，說(shuō)明對(duì)照品溶液在顯色后2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。加樣回收率試驗(yàn)中，平均回收率為99.22%，RSD=1.7%，回收率合格。

2.1.5 樣品含量測(cè)定 取12批藥材按“2.1.2”制備供試品溶液，按“2.1.3”方法測(cè)定總皂苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的香加皮中山西、甘肅和河南的香加皮總皂苷含量幾乎都是>200 mg/g，而四川、河北、安徽的香加皮總皂苷含量都不足200 mg/g。

2.2 HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 液相條件 色譜柱：Capcell pak C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0～45 min：10%A→33%A；45～45.01 min：33%A→56%A；45.01～55 min：56%A→80%A；55～65 min：80%A→92%A；65～70 min：92%A→100%A；70～72 min：100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：263 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA對(duì)照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇超聲（53 kHz）溶解并定容，搖勻，制得對(duì)照品單標(biāo)溶液。各取1 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻，得對(duì)照品混標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取香加皮藥材最細(xì)粉2 g，加入75%乙醇25 mL，超聲（53 kHz）1 h，將提取液離心（5000 r/min，10 min）取上清作為供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察 供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.1%；各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD均在3%之內(nèi)，表明儀器的精密度較好。6份樣品中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.4%；相對(duì)峰面積的RSD均在2.9%之內(nèi)，表明重復(fù)性較好。供試品24 h內(nèi)各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.5%；相對(duì)峰面積的RSD均在2.9%之內(nèi)，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 不同產(chǎn)地香加皮HPLC指紋圖譜采集和共有峰的標(biāo)定 取12批藥材制備供試品溶液并測(cè)定，記錄HPLC色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件對(duì)香加皮指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰25個(gè)，建立藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，見(jiàn)圖1～2。

2.2.6 共有峰的指認(rèn) 取對(duì)照品混標(biāo)溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，得出對(duì)照品的保留時(shí)間分別與色譜圖上的峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24、峰25保留時(shí)間一致，由此初步確定峰19為PSK，峰20為WJ53，峰21為WJ521，峰22為PSD，峰23為WJ33，峰24為WJ32，峰25為PSA。

2.2.7 相加皮藥材相似度評(píng)價(jià) 采用指紋圖譜相似度軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》計(jì)算。香加皮藥材HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。12批香加皮除S7以外，相似度均在0.9以上，說(shuō)明從指紋圖譜角度看，不同產(chǎn)地的香加皮藥材質(zhì)量有差異也有共性。

2.3 指紋圖譜結(jié)合總皂苷含量的系統(tǒng)聚類(lèi)分析

以12批藥材中總皂苷含量中最大值作為基準(zhǔn)對(duì)12批藥材中總皂苷含量進(jìn)行歸一化處理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，得到聚類(lèi)樹(shù)狀圖3。結(jié)果顯示，除第7批相似度較低外，其余11批香加皮樣品被分為兩類(lèi)，主要為高含量組和低含量組。高含量組包括產(chǎn)地為河南、山西、甘肅的香加皮藥材，低含量組包括山西、甘肅、河北、四川、安徽的香加皮藥材，而山西和甘肅的香加皮藥材含量不一。表明基于總皂苷含量及相似度的綜合評(píng)價(jià)可用于香加皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及比較。endprint

3 討論

紫外測(cè)總皂苷實(shí)驗(yàn)前期對(duì)顯色劑種類(lèi)、比例、用量和顯色反應(yīng)溫度、時(shí)間分別進(jìn)行了考察比較，確定了最佳顯色條件。并對(duì)供試品制備中提取溶劑、溶劑體積和提取時(shí)間進(jìn)行考察，確定最佳提取條件。

指紋圖譜實(shí)驗(yàn)前期分別比較不同溶劑對(duì)相加皮藥材的提取效果，結(jié)果75%乙醇的供試品峰數(shù)目較多且峰形較好，含量較均勻；考察了超聲、回流兩種提取方式，其中超聲提取色譜信息更完整；考察了多種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.2%甲酸流動(dòng)相系統(tǒng)，基線最為平穩(wěn)，峰形較好。

紫外測(cè)總皂苷含量結(jié)合HPLC指紋圖譜分析評(píng)價(jià)法可在一定程度上表征不同產(chǎn)地來(lái)源不同批次的藥材在皂苷含量方面的差異，基于兩者的綜合信息，可以為香加皮的產(chǎn)地選擇、臨床應(yīng)用及質(zhì)量快速評(píng)價(jià)提供參考。在此基礎(chǔ)上，若能將藥效、毒性與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來(lái)，深入開(kāi)展研究，則更有利于闡明中藥作用制劑，完善香加皮的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為用藥安全提供進(jìn)一步保障。

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（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：李亞聰）endprint