微量生色底物法測定肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價

李想　馬宏達　吳瓊

[摘要] 目的 建立肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價的測定方法。 方法 對肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏進行破乳處理后，采用微量生色底物法、生物檢定統計法，測定乳膏中抗Xa因子的效價。 結果 建立了肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中肝素鈉抗Xa因子的測定方法，抗Xa因子在0.0250～0.1020 IU/mL范圍內與吸光度（A）值線性關系良好（r=0.996）；低、中、高濃度的平均回收率為99.5%，RSD為1.92%（n=9）。抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比值在0.9～1.1范圍內。 結論 該方法結果準確，重復性好，可用于肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價的測定，有效控制該制劑的質量。

[關鍵詞] 微量生色底物法；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏；抗Xa因子；效價

[中圖分類號] R961 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0030-03

[Abstract] Objective To establish a method for determination of anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. Methods The emulsion was broken. The anti-FXa potency was determined by micro-chromogenic substrate method and biological test statistics method. Results The determination method was established for anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. The linear range of anti-FXa was during 0.0250-0.1020 IU/mL （r=0.996）. The average recovery in three levels was 99.5% （RSD=1.92%， n=9）. The ratio of potency was during 0.9-1.1 for anti-FXa and anti-FⅡa. Conclusion The method is accurate and reproduceable. It can be used for the determination of anti-FXa potency in order to control the quality of heparin sodium and inositol nicotinate cream.

[Key words] Micro-chromogenic substrate method； Heparin sodium and inositol nicotinate cream； Anti-FXa； Potency

凍傷是指機體長時間暴露于寒冷環境，導致全身或局部體溫下降而產生的損傷[1-2]。輕度凍傷，主要損傷皮膚、肌肉[3]，重度凍傷損傷肌肉和骨，甚至導致殘廢、危及生命[4-5]。沈陽軍區總醫院研制的肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，防治凍傷效果顯著。該制劑由肝素鈉和肌醇煙酸酯組成[6]，通過擴張血管、改善微循環，使局部血流通暢，以消除凍傷部位紅腫、疼痛等癥狀。肝素鈉為硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬于多糖類物質[7-8]，肝素鈉與抗凝血酶Ⅲ結合，對凝血因子Ⅱa和Xa等具有抑制作用[9]，是臨床應用最廣泛的抗凝藥物之一[10-11]。準確測定肝素鈉抗Xa因子效價、測定抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比，既保證了有效性，又提高了安全性。在此前的研究中，課題組建立了乳膏中抗Ⅱa因子的效價測定方法[12]。本文采用微量生色底物法，測定抗Xa因子效價，方法準確、重復性好，可有效控制制劑質量，更好地服務于臨床。

1 材料與方法

1.1 儀器

120D型電子分析天平（北京島津公司）；電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特公司）；ELX800型酶標儀（BIO-TEX instruments，INC）；生物檢定統計程序BS2000（中國食品藥品檢定研究院編制）。

1.2 試藥

肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（沈陽軍區總醫院，規格：20 g：8000 IU；批號：20141113、20150108、20150109）；肝素鈉標準品（USP，9.5 mg-2144 IU）；抗凝血酶Ⅲ（Chromogenix，10 IU/瓶）；發色底物S-2765（Chromogenix，25 mg）；Xa因子（Chromogenix，71 nkat/支）；三羥甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 標準品溶液（S）：精密稱取肝素鈉標準品適量，加滅菌注射用水制成1 IU/mL的溶液，再加緩沖液稀釋成濃度為0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的標準品溶液，相鄰劑量組的濃度比值為1∶0.7。

供試品溶液（T）：取乳膏約2 g，精密稱定后加70%乙醇30 mL，置水浴上溶解，超聲30 min，放冷后移至200 mL量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻后置4℃冰箱過夜，取出濾過，取續濾液50 mL，置水浴上蒸發至無乙醇臭，移至50 mL量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，配制與標準品溶液相當的4個系列濃度溶液。

陰性樣品溶液：按處方量制備不含肝素鈉的乳膏，按“供試品溶液”配制方法制成陰性樣品溶液。

三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液（pH 8.4）：即空白溶液（B），取三羥甲基氨基甲烷6.06 g，氯化鈉10.23 g，乙二胺四乙酸二鈉2.80 g，聚乙二醇6000 1.0 g，加蒸餾水800 mL使溶解，用鹽酸調節pH值至8.4，用蒸餾水稀釋至1000 mL。endprint

抗凝血酶溶液：精密稱取抗凝血酶Ⅲ適量，加三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液溶解制成1 IU/mL的抗凝血酶Ⅲ溶液。

Xa因子溶液：精密稱取Xa因子適量，加三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液溶解并稀釋制成0.4 IU/mL（7.1nkat）的溶液。

發色底物溶液（S-2765）：精密稱取發色底物適量，加蒸餾水溶解使成0.001 mol/L的溶液。

終止液：取25 mL冰醋酸加水至50 mL，制成50%（v/v）醋酸溶液。

1.3.2 抗Xa因子效價的測定 效價測定前，進行空白調節：以空白溶液（B）代替供試品溶液測定抗Xa因子效價，調整Xa因子溶液的濃度，使空白溶液在405 nm波長處的吸光度（A）值在0.8～1.0范圍內。

分別取5 μL標準品溶液（S）、供試品溶液（T）及空白溶液（B），按濃度梯度順次加入到96孔板中（B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2），加入20 μL三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液，再加入25 μL的抗凝血酶Ⅲ溶液，混勻，37℃保溫2 min。每孔各加Xa因子溶液50 μL，混勻，37℃保溫2 min，再加入發色底物溶液（S-2765）50 μL，混勻，37℃保溫2 min，最后各孔加入終止液50 μL終止反應。在405 nm波長處測定各孔的A值。應用生物檢定統計程序BS2000、按生物檢定統計法中的量反應平行線原理4×4法，計算效價及實驗誤差。平均可信限率（FL%）不得>10%。

2 方法學考察

2.1 專屬性考察

取相同濃度的標準品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶液，于405 nm波長處測定A值。結果表明，陰性樣品溶液與空白溶液的A值無顯著差異，不干擾供試品測定，專屬性良好。

2.2 標準曲線的繪制

取1 IU/mL的肝素鈉對照品溶液，加緩沖液稀釋成濃度為0.0250、0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的標準溶液，分別取25 μL加入至96孔板中，其他按“1.3.2”測得A值，以A值為縱坐標，標準溶液的濃度（C）對數值為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=-0.6361LogC-0.2614，r = 0.996。結果表明，樣品濃度在0.0250～0.1020 IU/mL范圍內線性關系良好。

2.3 回收率試驗

精密稱取處方量80%、100%、120%的肝素鈉標準品各3份，按處方制備乳膏，按“1.3.1”制備供試品溶液，依法測定效價，計算回收率。平均回收率為99.5%，RSD為1.92%（n=9）。

2.4 精密度試驗

取效價為0.05 IU/mL對照品溶液，測定在405 nm波長處的A值，同時測定6份，計算得RSD為1.75%（n=6），精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同批次樣品6份，按“1.3.2”測定效價。結果表明，肝素鈉抗Xa因子活性均值為407 IU/g，RSD為1.82%（n=6），重復性良好。

2.6 樣品抗Xa因子效價測定

取3批肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏樣品，制備供試品溶液，按“1.3.2”測定效價，并計算抗Xa因子與抗Ⅱa因子效價的比值，結果見表1。

3 討論

傳統的肝素鈉效價測定方法是血液凝固法，雖然能間接反映抗凝活性，但是專屬性不強[13-15]。據文獻報道[16]，應用體積排阻色譜法測定抗Xa因子的活性，準確性和精密度高，但色譜柱成本高，且不適于乳膏劑。《中國藥典》2015年版收載的肝素鈉效價測定方法[17]，由2010年版的血液凝固法的修訂為生色底物法[18]，但未明確試劑加入量等反應條件。本研究采用微量生色底物法，在96孔板上加酶反應試劑，用酶標儀測定抗Xa因子效價。微量生色底物法較血液凝固法減少了人為因素，提高了專屬性、準確性和精密度；較生色底物法減少了酶反應試劑的用量，節約成本，可同時測定多個樣本，顯著提高了實驗效率。

抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比與肝素鈉誘發的潛在出血和血小板減少癥等有關[9]。《中國藥典》2015年版要求兩者的效價比應為0.9～1.1[17]。本研究測定肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比，均在限定范圍內，可用于肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏的質量控制。

在實驗操作的過程中，微量酶反應需注意以下幾點[19-20]。保證微量移液器的平行操作，以免影響精密度；嚴格控制酶反應時間及溫度，保證試劑活性，使反應完全；因終止液具有揮發性，為保證各孔的反應同步，應盡量加快操作速度。

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（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：李亞聰）endprint