不同試驗(yàn)周期下Cu對(duì)玉米種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)的影響

何穎妍 鄧桂榮 曾國(guó)驅(qū)

摘要：為探究植物種子是否會(huì)因?yàn)槭茉囄锉┞稌r(shí)間不同而得到不同的發(fā)芽抑制率、根長(zhǎng)下降率及EC50，進(jìn)而影響受試物生態(tài)毒理學(xué)危害性級(jí)別的判定，選用玉米為試驗(yàn)種子，CuSO4·5H2O為受試物，設(shè)置了6個(gè)受試物濃度組，開(kāi)展了周期為2～7 d的試驗(yàn)。結(jié)果表明：在中低暴露濃度下，不同周期對(duì)玉米種子發(fā)芽率影響較大，發(fā)芽抑制率的EC50最值相差高達(dá)352.9 mg/L，也使根長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性差異，但根長(zhǎng)下降率及其EC50無(wú)明顯差異。得出了試驗(yàn)周期不同，不影響CuSO4·5H2O生態(tài)毒理學(xué)危害性分級(jí)結(jié)果的結(jié)論。

關(guān)鍵詞：試驗(yàn)周期；發(fā)芽抑制率；根長(zhǎng)下降率；半最大效應(yīng)濃度

中圖分類號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2017）16000404

1引言

由于當(dāng)代環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，國(guó)家環(huán)保部門(mén)對(duì)化學(xué)品管理越來(lái)越嚴(yán)格。尤其是新化學(xué)物質(zhì)方面，在其登記注冊(cè)投入生產(chǎn)前需要進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)其產(chǎn)量進(jìn)行分類管理，減少化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境后的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

高等植物是生態(tài)系統(tǒng)基本的組成部分。目前有2種陸生植物生態(tài)毒理試驗(yàn)用于化學(xué)品測(cè)試[1]，一種是種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)的毒性試驗(yàn)，另一種是陸生植物生長(zhǎng)活力試驗(yàn)。前者常用于測(cè)定受試物對(duì)陸生植物種子發(fā)芽和根部伸長(zhǎng)的抑制作用，評(píng)價(jià)受試物對(duì)植物胚胎發(fā)育的影響。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)周期中最為關(guān)鍵的階段，也是對(duì)周?chē)h(huán)境最為敏感的時(shí)期[2，3]。目前，種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)毒性試驗(yàn)是我國(guó)新化學(xué)物質(zhì)陸生植物生態(tài)毒理測(cè)試中對(duì)受試物進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要技術(shù)之一[4]，明確規(guī)定進(jìn)行三級(jí)或以上申報(bào)時(shí)，應(yīng)提交該測(cè)試數(shù)據(jù)，除非受試物滿足如土壤吸附率過(guò)低等豁免條件[5]。

隨著中國(guó)加入了世界貿(mào)易組織（World Trade Organization， WTO），在與經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development， OECD）成員國(guó)進(jìn)行化學(xué)品國(guó)際貿(mào)易過(guò)程中所提交的測(cè)試數(shù)據(jù)必須為其準(zhǔn)則規(guī)定的方法。準(zhǔn)則對(duì)種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)毒性試驗(yàn)進(jìn)行了較為詳細(xì)的介紹，但對(duì)植物種子的試驗(yàn)周期卻沒(méi)有明確規(guī)定，僅說(shuō)明對(duì)照組種子發(fā)芽率在65%以上且根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)至少20 mm時(shí)，即可結(jié)束試驗(yàn)[6]。僅憑試驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定試驗(yàn)周期，主觀性強(qiáng)，較為隨意。植物種子是否會(huì)因?yàn)槭茉囄锉┞稌r(shí)間不同而出現(xiàn)不同的EC50，差異有多大，是否會(huì)影響受試物生態(tài)毒理學(xué)危害性分級(jí)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，研究不同試驗(yàn)周期下植物種子對(duì)受試物的響應(yīng)情況，具有重要的實(shí)用價(jià)值。

試驗(yàn)以石英砂為基質(zhì)，選用玉米為受試植物種子，CuSO4·5H2O為受試物。探究Cu在不同試驗(yàn)周期中對(duì)受試種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)毒性的影響，為測(cè)試機(jī)構(gòu)在工作實(shí)踐中優(yōu)化試驗(yàn)條件提供理論依據(jù)。

2材料與方法

2.1試驗(yàn)材料

2.1.1受試物

CuSO4·5H2O（≥99%），分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

2.1.2試驗(yàn)種子及處理

選用玉米（Zea mays）為受試種子。玉米為《化學(xué)品測(cè)試方法》推薦的受試植物之一，購(gòu)于廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所。

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將玉米種子放在去離子水中漂洗和浸泡1 h，未進(jìn)行消毒處理。試驗(yàn)時(shí)選取大小、飽滿度一致的種子，棄掉破損的種子。

2.1.3試驗(yàn)基質(zhì)

石英砂，粒徑為40～100 μm。

2.1.4儀器

人工氣候箱、三按鍵電子數(shù)顯卡尺、手提式pH測(cè)試儀、DSR系列溫濕度記錄儀。

2.2試驗(yàn)條件

25±1 ℃，黑暗。

2.3試驗(yàn)方法

2.3.1試驗(yàn)操作

設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組和6個(gè)受試物處理組，每個(gè)平行10粒種子。用CuSO4·5H2O作為基質(zhì)中Cu的來(lái)源，濃度以Cu計(jì)。受試物濃度系列分別為0、10.0、50.0、100、500、800、1000 mg/L。

試驗(yàn)前測(cè)定石英砂的pH值[7]及其飽和含水量[8]。按石英砂飽和含水量的60%將受試物溶液添加至石英砂中（空白對(duì)照組以去離子水替代），充分混勻后，分裝至培養(yǎng)皿中，再將玉米種子置于石英砂表面，輕壓入內(nèi)，覆蓋少量石英砂，并保持種子胚根末端和生長(zhǎng)方向成一直線。蓋好培養(yǎng)皿，并用保鮮膜密封。將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中，呈極小的角度便于根的直線生長(zhǎng)。

分別在第2、3、4、5、6、7 d從每個(gè)試驗(yàn)組中隨機(jī)取出2個(gè)平行，計(jì)算發(fā)芽率，并使用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量各種子根長(zhǎng)，根長(zhǎng)的測(cè)定從位于胚軸和根的轉(zhuǎn)換點(diǎn)到根尖末端。當(dāng)種子初生根的長(zhǎng)度達(dá)5 mm時(shí)，視為發(fā)芽。

2.3.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Microsoft Office Excel 2003統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、平均根長(zhǎng)、發(fā)芽抑制率以及根長(zhǎng)下降率。分別使用SPSS Statistics 17.0和Trimmed Spearman-Karber Method進(jìn)行根長(zhǎng)單因素方差分析以及計(jì)算根伸長(zhǎng)下降率和發(fā)芽抑制率EC50及其95%置信限。統(tǒng)計(jì)顯著水平設(shè)為P=0.05。

3結(jié)果與分析

3.1不同試驗(yàn)周期對(duì)玉米種子發(fā)芽率的影響

從表1可知，試驗(yàn)進(jìn)行至第3d時(shí)，空白對(duì)照組的發(fā)芽率已達(dá)到試驗(yàn)結(jié)束質(zhì)量控制的最低要求，且在第5d得到最大值，發(fā)芽率開(kāi)始時(shí)隨著試驗(yàn)周期增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，最后穩(wěn)定下來(lái)。當(dāng)Cu濃度較低如10 mg/L和50 mg/L時(shí)，在各試驗(yàn)周期中玉米種子發(fā)芽率與空白對(duì)照組持平甚至更高，總體上未呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，甚至有點(diǎn)促進(jìn)作用。而當(dāng)Cu濃度提高至500 mg/L及以上時(shí)，玉米種子的發(fā)芽率均保持顯著抑制，與試驗(yàn)周期的長(zhǎng)短不存在明顯關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)周期的長(zhǎng)短對(duì)玉米種子發(fā)芽率的影響不明顯，總體均符合“低促高抑”的現(xiàn)象。endprint

3.2不同試驗(yàn)周期對(duì)玉米種子根長(zhǎng)的影響

從表2可知，空白對(duì)照組和低濃度組（10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L）的平均根長(zhǎng)幾乎隨著試驗(yàn)周期的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，而濃度為500 mg/L、800 mg/L和1000 mg/L的平均根長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定。這與表4的根長(zhǎng)單因素方差分析結(jié)果是吻合的，這表明增長(zhǎng)暴露時(shí)間，會(huì)使低濃度受試物組的平均根長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性差異，而高濃度受試物組則不顯著。

由表3可以看出，根長(zhǎng)下降率與Cu濃度都具有較好的線性關(guān)系，Cu濃度越大對(duì)種子根部生長(zhǎng)抑制作用就越強(qiáng)。在低濃度組（10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L）中不同試驗(yàn)周期的根長(zhǎng)下降率差異較大。如當(dāng)Cu濃度為50 mg/L時(shí)，試驗(yàn)第3d的根長(zhǎng)下降率為33.6%，第4d僅為4.6%，兩者差別為29%，當(dāng)Cu濃度為100 mg/L時(shí)，試驗(yàn)第4d的根長(zhǎng)下降率為47.8%，第7d為79.0%，兩者差別為31.2%。當(dāng)Cu濃度為500 mg/L及以上時(shí)，同一濃度下不同試驗(yàn)周期中的根長(zhǎng)下降率差異不大，而且根長(zhǎng)下降率有隨著試驗(yàn)周期的增長(zhǎng)而平穩(wěn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在不同試驗(yàn)周期中，施加同樣的Cu濃度對(duì)種子根長(zhǎng)生長(zhǎng)并未出現(xiàn)明顯的規(guī)律影響，但是可以看出試驗(yàn)周期對(duì)低濃度組的影響大于高濃度組。

3.3不同試驗(yàn)周期對(duì)玉米種子發(fā)芽抑制率和根長(zhǎng)下降率EC50的影響

由表5可知，在Cu系列濃度作用下，不同試驗(yàn)周期得到的發(fā)芽抑制率和根長(zhǎng)下降率的EC50均不一致。玉米種子發(fā)芽抑制率EC50在249.4～602.3 mg/L之間，最高值出現(xiàn)在第4d，最低值出現(xiàn)在第5 d，最值相差352.9 mg/L。玉米種子根長(zhǎng)下降率EC50在55.1～133.6 mg/L之間，最高值出現(xiàn)在第4d，最低值出現(xiàn)在第7d，最值相差78.5 mg/L。從發(fā)芽抑制率和根長(zhǎng)下降率的EC50都可以看到3d、4d試驗(yàn)周期的EC50均明顯高于5 d、6 d、7 d的，而且后三者的EC50較為接近。由此可以看出，長(zhǎng)試驗(yàn)周期可以得到更加穩(wěn)定、可靠的EC50。

4討論

在不同試驗(yàn)周期中，Cu對(duì)玉米種子發(fā)芽存在“低促高抑”現(xiàn)象，這與高柱[9]的研究結(jié)果一致。種子的發(fā)芽類型可以歸為三類，即冒險(xiǎn)型、機(jī)會(huì)型和穩(wěn)定型[10]。一般來(lái)說(shuō)，種子發(fā)芽即便是在合適的環(huán)境條件下還是需要一段適應(yīng)和誘導(dǎo)時(shí)間。這可能是由于種子在發(fā)芽過(guò)程養(yǎng)分的供應(yīng)主要是來(lái)自于胚內(nèi)，直接從胚乳中吸取養(yǎng)分。種子一般先通過(guò)吸水膨脹，然后激活體內(nèi)酶原，進(jìn)而合成新酶，開(kāi)始進(jìn)入發(fā)芽狀態(tài)[11，12]。雖然導(dǎo)則規(guī)定空白對(duì)照組種子發(fā)芽率大于65%，根伸長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到20 mm，即可結(jié)束試驗(yàn)，但是在短時(shí)間試驗(yàn)周期中，根據(jù)種子發(fā)芽的規(guī)律，種子沒(méi)有足夠充分時(shí)間發(fā)芽，部分種子還處于適應(yīng)期，雖能滿足試驗(yàn)結(jié)束的要求，但不利于探究受試物對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響，未能充分地體現(xiàn)出受試物的作用。而在長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)周期中的種子能有充足時(shí)間發(fā)芽，能更好地體現(xiàn)出受試物對(duì)種子發(fā)芽的影響。在該研究中，玉米種子發(fā)芽抑制率的EC50表明：5 d試驗(yàn)周期是最合適的。因此在探究有毒性的受試物對(duì)植物種子發(fā)芽影響的研究當(dāng)中，適當(dāng)?shù)卦鲩L(zhǎng)試驗(yàn)周期可能會(huì)有利于更好地體現(xiàn)出受試物的影響。

隨著試驗(yàn)周期的增加，低濃度組的平均根長(zhǎng)有顯著性差異，高濃度組則不顯著，同一濃度之間的根長(zhǎng)下降率也沒(méi)有顯著差異。這可能是與玉米種子根系直接接觸受試物有關(guān)，根系生長(zhǎng)受到直接影響。當(dāng)受試物濃度較低時(shí)，其毒性不足以抑制根生長(zhǎng)，所以根部隨著試驗(yàn)周期的延長(zhǎng)而明顯增長(zhǎng)，但提高受試物濃度后，在較強(qiáng)的毒性作用下，試驗(yàn)周期延長(zhǎng)對(duì)根部生長(zhǎng)的貢獻(xiàn)甚微。Liu等[13]指出，與植物種子發(fā)芽有關(guān)的各種指標(biāo)的敏感順序?yàn)椋焊L(zhǎng)>根生物量>芽長(zhǎng)>總生物量>地上部生物量>發(fā)芽率。有研究指出，發(fā)芽率是最不敏感的指標(biāo)[14]。通過(guò)比較玉米種子發(fā)芽抑制率和根長(zhǎng)下降率的EC50，可以發(fā)現(xiàn)根長(zhǎng)下降率的EC50遠(yuǎn)小于發(fā)芽抑制率EC50，表明根生長(zhǎng)對(duì)受試物響應(yīng)比發(fā)芽率更為敏感，此結(jié)果與Liu等的結(jié)論相符合，也與Kjaer[15]研究結(jié)果相似。在該研究中，玉米種子根長(zhǎng)下降率的EC50表明5d試驗(yàn)周期是最合適的，試驗(yàn)敏感性最高。由此說(shuō)明，在滿足試驗(yàn)條件下，有毒性的受試物暴露試驗(yàn)周期的長(zhǎng)短是不會(huì)影響種子的根長(zhǎng)下降率，均可體現(xiàn)受試物毒性。

在新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)過(guò)程中，根據(jù)種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)試驗(yàn)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)可以將新化學(xué)物質(zhì)環(huán)境危害性分為3類別，即急性毒性極高、急性毒性高和急性毒性中等，分別對(duì)應(yīng)的LC50為≤1 mg/L、1～10 mg/L和10～100 mg/L[16]。在該研究中玉米種子發(fā)芽抑制率的EC50均處于低級(jí)危害水平，說(shuō)明不同試驗(yàn)周期不影響CuSO4·5H2O的生態(tài)毒性學(xué)危害性分級(jí)結(jié)果。玉米種子根長(zhǎng)下降率的EC50除4d試驗(yàn)周期處于低級(jí)危害水平外，其他試驗(yàn)周期的均處于中級(jí)危害水平，不同試驗(yàn)周期對(duì)CuSO4·5H2O生態(tài)毒性級(jí)別沒(méi)有顯著影響。從玉米種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)整個(gè)毒性試驗(yàn)來(lái)看，不同試驗(yàn)周期對(duì)受試物的環(huán)境危害性級(jí)別的影響是不明顯的。

5結(jié)語(yǔ)

一個(gè)合適的試驗(yàn)周期可以保證試驗(yàn)敏感性。在新化學(xué)物質(zhì)登記評(píng)審中，“憑安全性舉證”和“疑者從重”是新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估的重要原則[17]，申報(bào)人需要提供必要的測(cè)試數(shù)據(jù)來(lái)證明所申報(bào)物質(zhì)對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性和可控性，而試驗(yàn)周期適當(dāng)增長(zhǎng)有利于提高化學(xué)物質(zhì)安全性的可信程度以及增加其可控性，減少進(jìn)入環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)，讓環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估真正有效地發(fā)揮作用。

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