內蒙古地區不同地理種群布氏田鼠遺傳分化研究

魏文天　王玉民　何宏軒

摘要 [目的]探討布氏田鼠地理種群的遺傳分化。[方法]以MHCⅡ類基因第二外顯子為分子標記進行序列分析和基因分型。結果：獲得了內蒙古8個布氏田鼠地理種群460個樣品的MHCⅡ類基因第二外顯子基因的261 bp核苷酸序列，經單倍型分選后，共定義了21個單倍型，其中有3個單倍型為不同區域種群所共享，其余19個單倍型均為各區域種群所特有。單倍型網絡進化關系分析顯示，8個布氏田鼠地理種群形成3個穩定的進化支，分別與采集的地理種群相吻合：同一地理種群內單倍型之間遺傳差異小，而不同地理來源的單倍型之間存在較大區別。AMOVA分析顯示，遺傳變異主要發生在區域類群間。對基因流和遺傳分化系數、種群遺傳距離和遺傳相似度分析表明，布氏田鼠種群出現了一定的遺傳分化，正鑲白旗種群因渾善達克沙漠的阻礙而分化最明顯。Mentel檢測揭示布氏田鼠的遺傳分化與地理距離無顯著相關性。[結論]棲息地的復雜地形和氣候變化可能是影響布氏田鼠群體間遺傳分化的主要因素，而種群間距離隔離對于布氏田鼠的遺傳分化作用不明顯。

關鍵詞 布氏田鼠；地理種群；MHCⅡ類基因；遺傳分化；內蒙古

中圖分類號 Q958.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）16-0220-04

Abstract [Objective]Explore the genetic differentiation of geographical populations of Lasiopodomys brandtii.[Methods]Sequences were analyzed based on MHC Class Ⅱ gene exon 2.[Results]261 bp nucleotide sequences of MHC ClassⅡexon 2 from 460 individuals of 8 L.brandtii populations were analyzed by the methods of polymerase chain reaction and direct sequencing. Result showed that 21 genotypes were detected from 460 individuals of 8 L.brandtii geo-populations in Inner Mongolia.Median-joining network grouped 21 haplotypes into three distinct clades，which corresponded to three geographic areas，indicating an obvious phylogeographic pattern. AMOVA showed that most of the genetic variation occurred among geographic groups.The analysis results of gene flow and F-Statistics，genetic similarity and genetic distance indicated that that genetic differentiation already occurred among geographic groups，Zhengxiangbaiqi population was separated geographically from all others，indicating that Hunshandake Sandy Land might make an effective barrier against gene flow.The result of Mantel test illustrated that there were no significant correlations between genetic distance and geographic distance.[Conclusions]Complex topographic configuration and climatic changes of habitat played the most important role and geographic distance was not significant in the genetic differentiation of L.brandtii populations.

Key words Lasiopodomys brandtii；geo-populations；MHC ClassⅡgene；genetic differentiation；Inner Mongolia

種群遺傳學認為地理特征（地形障礙、空間距離等）或者歷史事件（棲息地片段化、冰期隔離、種群擴張等）是限制基因流的重要因素，會影響種群遺傳結構的形成過程，引起種群間的遺傳分化[1-2]。

內蒙古自治區地形地貌復雜。在其中部地區、東部地區分布著毛烏素沙地、渾善達克沙地、烏珠穆沁沙地、科爾沁沙地、呼倫貝爾沙地，且氣候多變，具有降水量少而不勻、寒暑變化劇烈的顯著特點。本區分布的物種遺傳結構受到了復雜的地質歷史和地理特征的影響[3]。

布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）屬嚙齒目（Rodentia）倉鼠科（Cricetidae）田鼠亞科（Microtinae），為內蒙古草原代表性小型哺乳動物，是危害草原和鼠疫傳播的宿主。種群成呈點狀、片段化、間斷性分布于內蒙古中部地區、東部地區，因其擴散能力弱，對棲息地環境有很強的依賴性，因而是研究復雜生境中環境壓力對種群遺傳影響的典型生物物種[4-6]。由于布氏田鼠長期受特定的地理環境條件脅迫和棲息地片段化的雙重作用，有可能導致種群在分子水平上的差異而分化為不同的適應性種群，對草原的保護和疫病防治產生重要影響。Wang等[7]基于微衛星標記對內蒙古4個布氏田鼠地理種群遺傳結構分析表明，受草原荒漠化的影響，種群內近交現象嚴重，基因流呈現海島模式，正鑲白旗種群與其他種群出現分化。endprint

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex， MHC）作為分子標記已被廣泛應用于物種間的系統關系、進化歷史和種群遺傳結構的研究[8-10]。為得到布氏田鼠種群遺傳分化的分子證據，為布氏田鼠的防治提供科學依據，本文基于MHCⅡ類基因探討了內蒙古地區布氏田鼠不同地理種群的遺傳相似性和遺傳差異、遺傳距離與地理距離之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究區域和樣本采集

樣品采自8個種群，分別來源于錫林浩特（XL，44°50.351′N，115°13.673′E；n=68）、二連浩特（EL，43°53.245′N，112°23.564′E；n=65）、東烏珠穆沁旗（DW，44°59.454′N，116°10.846′E；n=54）、西烏珠穆沁旗（XW，44°5.211′N，117°57.324′E；n=53）、新巴爾虎左旗（XZ，49°18.152′N，118°03.776′E；n=56）、陳巴爾虎旗（CB，49°32.652′N，119°44.735′E；n=52）、新巴爾虎右旗（XY，48°21.625′N，118°22.573′E；n=50）、正鑲白旗（ZX，42°25.611′N，115°16.331′E；n=62）地區，共460只布氏田鼠，各取樣點間的距離不低于100 km。樣品采集信息及種群分布見圖1。

1.2 基因組DNA提取與PCR擴增

用DNA試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取基因組。從GenBank下載布氏田鼠親緣種的MHCⅡ類基因第二外顯子序列（AJ003232，AF084934，U88933，M73960，BC132163，K0012，AJ634270）作為參考序列，經 Blast 比對篩選出保守片段，通過軟件Primer premier 5.0設計1對引物：5′-GGAA-TACGGTACATCTGAG-3′（上游引物MF）、5′-CAACTCTCC-GCCGCACAAGG-3′（下游引物MR），并由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應在PTC-200型DNA擴增儀上進行，PCR反應體系總體積為30 μL，其中含有1.0 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、1.5 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、150 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol，1U Taq DNA聚合酶，30 ng DNA。

反應程序為94 ℃變性45 s，54 ℃復性50 s，72 ℃延伸50 s，共進行30個循環。循環前95 ℃預變性5 min，循環后繼續延伸10 min。用1.5%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行正反測序。

1.3 數據分析

用Chromas 軟件對測序原始結果進行人工校對，用MEGA（version 5.0）軟件進行序列比對分析；用Network 4.6.0.0軟件[11]構建布氏田鼠種群的中介網絡圖（median-joining ne-twork）。

利用POPGENE version 1.32軟件分析計算種群的遺傳距離（GD）和遺傳相似度（GI）；用Arlequin 3.5 version[12]軟件計算區域種群間的基因流Nm（gene flow）和遺傳分化系數Fst（F-Statistics），用該軟件中的分子變異分析（analysis of mol-ecular variance， AMOVA）檢測地理種群內和地理種群間的遺傳分化。以種群為單位，用Arlequin 3.5 version軟件的Mantel檢驗（permutation=3 000）分析種群間遺傳距離（GD）和地理距離（GGD）的相關性。

2 結果與分析

2.1 MHCⅡ類基因第二外顯子序列特征

本研究測定了8個地理種群的460只布氏田鼠的MHCⅡ類基因第二外顯子序列，序列長261 bp。經單倍型分選后，在460個樣品中共存在21種單倍型，分別命名為H01-21（圖2）。以單倍型H01（Haplotype 01）為標準進行多態位點分析，有57個突變位點，包括10個單突變位點、47個簡約信息位點，突變位點百分率為21.84%。

2.2 單倍型網絡進化關系分析

單倍型網絡進化關系分析結果顯示，21個單倍型分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ三進化枝。其中，位于內蒙古東北部的陳巴爾虎等3個種群有10個單倍型，位于內蒙古中部的錫林浩特等4個種群10個單倍型，位于渾善達克沙漠南部的正鑲白旗種群7個單倍型，8個地理種群有3個共享單倍型（圖3）。3個進化枝分別與采集的地理種群相吻合。

2.3 布氏田鼠種群的遺傳分化

作為影響種群遺傳分化的重要因素——基因流，其流越弱，表明群體間的基因流水平較低，種群間遺傳分化較大。按單倍型網絡進化關系分析劃分的3個區域類群之間的基因流（Nm）和遺傳分化系數（Fst）值如表1所示。類群間的遺傳分化指數FST值分析顯示，區域類群GroupⅠ與GroupⅡ的Fst值為0.3646，區域類群GroupⅢ與其他區域類群的Fst值為0.823 2～0.834 7，布氏田鼠類群Fst P值均<0.05的檢驗水平。區域類群GroupⅠ與GroupⅡ的Nm為0.234 2，區域類群Group Ⅲ與其他區域類群的Nm為0.098 8～0.103 7，各種群間的基因交流均<1，尤其是類群Group Ⅲ與其他 2個種群之間的基因交流值最小。

以上分析揭示區域類群GroupⅠ與GroupⅡ間出現了分化的趨勢，但遺傳分化水平相對較低，而Group Ⅲ的正鑲白旗種群與其他種群之間有較高的遺傳分化。根據地理分布及系統分析結果，將3個地理種群和8個小種群進行遺傳變異的分子變異等級分析（AMOVA），結果見表2。區域類群間的遺傳變異占總變異比率的64.08%，區域內種群間的變異組分為7.78%，小群體內的變異組分為28.14%。區域內種群間小種群之間的遺傳變異要小于區域類群間的遺傳變異，布氏田鼠具有很高的遺傳結構。遺傳變異主要發生在區域之間和種群內，且P值顯著。endprint

種群間的遺傳距離（GD）、遺傳相似度（GI）和地理距離（GGD）見表3。各種群間親緣關系的遠近可以通過Nei′s標準遺傳距離（GD）和遺傳相似度（GI）的大小反映，當GI≥0.6時，認為各種群間的基因交流非常頻繁。遺傳距離分析揭示，布氏田鼠種群之間的遺傳距離最小值為0.092 1，最大值為0.246 7，其中正鑲白旗種群與其他種群的遺傳距離在0.197 9～0.246 7之間，遺傳距離大，分化明顯。遺傳相似度分析顯示，布氏田鼠種群之間的遺傳相似度在0.507 4～0.921 1之間，除正鑲白旗種群與其他種群遺傳相似度均<0.6，其他種群之間的遺傳相似度均>0.6。以上分析結果反映正鑲白旗種群與其他種群間基因交流較低，與上述遺傳分化的結果基本一致。

2.4 Mantel test分析

種群間的遺傳距離（GD）與地理距離（GGD）見表3。在地理距離隔離的Mantel檢驗中，統計遺傳距離和地理距離后，將遺傳距離同地理距離之間做相關性檢驗，判斷布氏田鼠地理種群間是否存在地理隔離因素。應用SPSS對8個種群遺傳距離與各采樣點間地理距離做回歸分析，得到了地理距離與遺傳距離的關系圖（圖4）。可以看出，數據點比較分散的分布于折線周圍，沒有明顯的規律性。Mantel檢驗結果顯示R2=0.315 9，P>0.05，表明種群間的遺傳距離和地理距離無顯著相關性。

3 結論與討論

遺傳結構是種群中遺傳變異分布的時空格局，它受突變、基因流、自然選擇和遺傳漂變的影響，或者是取決于種群單位間的擴散規模[13-15]。種群遺傳結構的改變和種群分化是研究微進化過程的核心內容[16-18]，也是物種形成過程中具有決定意義的一步。Wang等[7]對內蒙古3個布氏田鼠地理種群遺傳結構分析顯示，種群呈現較高水平的遺傳分化，遺傳分化與地理距離沒有顯著相關性，布氏田鼠有限的遷徙能力和棲息地破碎化是引起種群遺傳分化的重要因素。

本研究采集來自內蒙古中部和東北部的8個布氏田鼠種群，構建的單倍型中介網絡圖直觀的表明布氏田鼠種群21種單倍型分布于3個類群，分別與采集的地理種群相吻合：同一地理種群內單倍型之間遺傳差異小，而不同區域種群間的單倍型之間存在較大區別。基于基因流、遺傳分化系數等數據分析表明，正鑲白旗種群與其他種群間的分化較顯著，而GroupⅠ和GroupⅡ區域類群間已呈現分化趨勢。導致種群分化可能有以下因素：首先，田鼠形成于8～7 MaBP以前，在第三紀（距今800萬年至250萬年前）田鼠棲息地呈廣泛、連續分布[19]。第四紀（距今248萬年前）青藏高原抬升及多次冰期、間冰期的影響，使原連續分布的田鼠呈現隔絕、間斷、點、片狀、不連續分布[19]。內蒙古高原為田鼠提供了冰期避難場所，而生物避難場所由于種群空間分離形成異域種群，為新種或新亞種形成提供條件[20]，這是引起種群遺傳分化的地質因素。其次，布氏田鼠的遷徙在很大程度上受到內蒙古草原復雜多變的地形地貌的影響，削弱了種群間的基因交流。尤其是渾善達克沙地形成了布氏田鼠的遷徙地理屏障，逐漸把GroupⅢ與其他區域類群隔離開來，在長期進化過程中產生遺傳分化，這是引起種群遺傳分化的地理因素。再次，內蒙古自治區地形狹長，不同地理區劃內的氣候、地形、植被條件對布氏田鼠的分布和生存有重要影響。因此，棲息地片段化和復雜多變的地理氣候形成的生境隔離在很大程度上影響了本來就很有限的布氏田鼠遷徙能力，從而削弱了種群間的基因交流，這是引起布氏田鼠種群遺傳分化的生態因素。最后，布氏田鼠是一種營聚集生活的小型哺乳動物，雖然分布區域廣、繁殖力強，但擴散能力相對較弱，因而可能較易受距離隔離的影響而限制了種群間基因交流，這是產生遺傳分化的物種因素。距離隔離[21]理論認為，空間距離因素會限制基因流在種群間發生，導致種群產生遺傳分化，并隨著種群間地理距離的增加，其遺傳差異性也不斷增大。

古生物學和生態學證據表明，一些小型嚙齒類動物會強烈地依賴特定的棲息地生境，環境的影響會改變其遺傳模式[22]。黃 翔等[23]對蒙新區子午沙鼠種群遺傳結構的研究表明，子午沙鼠種群遺傳結構與地理距離沒有顯著的相關性，而影響種群遺傳結構的關鍵因素是蒙新干的海拔。

本文研究的8個布氏田鼠種群之間的地理距離基本超過200 km，遺傳距離與地理距離的回歸分析和Mantel檢驗顯示，布氏田鼠種群遺傳分化與地理距離沒有顯著相關性，表明地理距離對該研究區域的布氏田鼠種群分化格局影響微小，即使在地理上相距較遠的種群間也沒有顯著的遺傳差異，說明種群間隔距離對于布氏田鼠的遺傳分化影響不是主要因素。

4 致謝

感謝中國科院內蒙古錫林郭勒草原生態系統國家野外觀測研究站，中科院動物所農業蟲害鼠害國家重點實驗室張強博士和鄭州大學謝東明研究生在樣品采集過程中的幫助。

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