大鯢皮膚黏液中抑菌成分的提取與分析

王茁

摘要 分別使用電刺激法和直接刮擦法刺激大鯢，收集其所分泌的黏液。利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鯢體表黏液獲得了大鯢低聚糖肽，研究大鯢低聚糖肽的酶解法條件、生物學特性、理化活性。 結果表明，大鯢皮膚黏液中存在抑菌成分，即低聚糖肽。

關鍵詞 大鯢；皮膚黏液；抑菌成分；提取；低聚糖肽

中圖分類號 TS254.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）16-0226-01

Abstract Andrias davidianus were stimulated by electrical stimulation and direct scratches to collect the mucus. The enzymatic conditions，biological characterisics，physical and chemical activity of oligosaccharides from Andrias davidianus boby mucus were studied by enzymolysis of marine aspergillus acidic protease.The results showed that there was antibacterial component in the skin mucus of Andrias davidianus，that was oligosaccharide peptide.

Key words Andrias davidianus；skin mucus；antibacterial component；extraction；oligosaccharide peptide

中國大鯢（Andrias davidianus），屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國二級保護動物[1]。其肌肉、皮膚、器官、骨骼等都可以入藥[2]，經常食用大鯢具有延緩衰老、聰明益智、提高造血和免疫功能的功效，有助于防治惡性貧血、心腦血管系統疾病和惡性腫瘤[3]。

人工養殖的大鯢皮中富含膠原蛋白，其含量約占大鯢皮中蛋白質總量的63.69%，大鯢皮膠原蛋白多肽還含有7種人體必需氨基酸，并具有良好的吸水性、保水性、濕潤性等，可以直接用于食品中，有豐富的營養價值和藥用保健價值[4]。

本文將大鯢體表黏液利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶（Aspergillus sp. Acid protease）進行酶解，獲得大鯢低聚糖肽，進而研究了大鯢低聚糖肽的酶解法條件、生物學特性、理化活性[5-6]。這對大鯢體表黏液的深加工利用具有一定的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大鯢；海洋曲霉菌酸性蛋白酶；清潔級昆明種小鼠，體質量18～22 g，雌、雄各1/2。

1.2 材料處理

分別使用電刺激法和直接刮擦法刺激大鯢，收集其所分泌的黏液，用無菌水清洗，冷凍，收集備用[7-9]。

1.3 最優酶解條件

通過正交試驗，證實溫度55 ℃、pH=2.0、E/S 0.03%、酶解時間3 h為海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鯢體表黏液的最優酶解條件。研究大鯢酶解物溶液共晶點、凍融過程以及冷凍濃縮過程，發現冷凍干燥操作前，于-15.6～-10.6 ℃對大鯢酶解物溶液進行預凍結，可使大鯢酶解物溶液濃度得到提高[5-7，10-12]。

1.4 飛行質譜檢測

大鯢黏液酶解物經飛行質譜檢測后被確認為大鯢低聚糖肽，且分子量低于3.5 kDa。大鯢低聚糖肽總糖含量、總蛋白含量分別為16.65%、82.61%。總糖中半乳糖醛酸、鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、唾液酸占大鯢低聚糖肽的比例分別為2.55%、3.29%、0.85%、0.55%[13-14]。

經測定，大鯢低聚糖肽中氨基酸含量豐富，符合人體營養需求，除色氨酸未測出外，還含有較高的人體其他7種必需氨基酸，其中蘇氨酸（Thr）、谷氨氨酸/酰胺（Glx）、絲氨酸（Ser）的含量分別達13.8%、12.6%、0.23%[8-11，15]，以蘇氨酸（Thr）的含量最高。

1.5 不同劑量大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能的影響

按體質量將小鼠分成3個劑量組，分別為0 g/kg體重（對照組）、0.01 g/kg體重（低劑量組）、0.1 g/kg體重（高劑量組）[5]，用大鯢低聚糖肽飼喂小鼠8 d后，研究發現，較之飼喂大鯢低聚糖肽0 g/kg體重的小鼠，飼喂大鯢低聚糖肽0.01、0.10 g/kg體重的小鼠的血清中免疫球蛋白含量、T淋巴細胞活性、巨噬細胞數與對照組相比均顯著提高。

選雌性小鼠隨機分成空白對照組、CCL4模型對照組和聯苯雙酯陽性對照組[210 mg/（kg·d）]，以及大鯢低聚糖肽高濃度劑量組[900 mg/（kg·d）]、低濃度劑量組[250 mg/（kg·d）]。各給藥組給藥灌胃2次/d，連續給藥10 d后，測定大鯢低聚糖肽對小鼠肝細胞損傷的保護作用[4-5]。

將大鯢低聚糖肽按照2個濃度劑量，即150 mg/kg體重（低濃度組）和180 mg/kg體重（高濃度組）連續喂食小鼠，并每天按劑量0.3 mL/20 g體重灌胃，而對照組灌服相同體積的生理鹽水，24 d后進行小鼠負重游泳試驗[5-7]。結果顯示，飼喂大鯢低聚糖肽180 mg/kg體重的小鼠的游泳竭力增加到80.5 min（P<0.01）。

2 結果與分析

2.1 大鯢低聚糖肽清除自由基的作用

大鯢低聚糖肽具有明顯清除自由基的能力，清除超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基的能力隨著濃度升高而逐漸增強。當濃度為2 mg/mL時，超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除率分別達58.69%、91.25%、52.53%。endprint

2.2 不同劑量大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能的影響

光鏡檢查結果表明，CCl4模型組肝細胞明顯腫脹變形，肝細胞索排列紊亂無序，并伴有炎癥細胞侵潤[5-6]。而大鯢低聚糖肽高劑量組中小鼠肝臟組織中血清谷草轉氨酶（AST）活性、谷丙轉氨酶（ALT）活性得到有效提升，而丙二醛（MDA）含量得到顯著降低，促進了對超氧化物岐化酶（SOD）活性的提高。與模型組相比，大鯢低聚糖肽各劑量組的肝細胞排列有序、肝細胞索排列整齊，肝組織的損傷明顯減輕[5-7]。

3 討論

綜上所述，本研究證明了大鯢皮膚黏液中存在抑菌成分，主要是低聚糖肽，該物質在不同領域有不同的作用，不同劑量的低聚糖肽對動物產生的影響也不同。并且介紹了提取低聚糖肽的方法——海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解法，以及對低聚糖肽利用價值的分析。由此可見，大鯢皮膚黏液中的低聚糖肽會使生物科學技術有很大的進展。

4 參考文獻

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