氯化鉀溶液刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞對Tets基因表達(dá)的影響

郝凌云，王沁玥，孫夢蘭，潘志強

徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 22100

氯化鉀溶液刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞對Tets基因表達(dá)的影響

郝凌云，王沁玥，孫夢蘭，潘志強

徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 22100

目的 觀察氯化鉀（KCl）溶液刺激人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87)，不同濃度KCl對Tets基因 mRNA表達(dá)的影響。方法 2017年2—4月，徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉重點實驗室，U87細(xì)胞用不同濃度KCl刺激，Trizol法提取總RNA，以Real-time PCR方法檢測結(jié)果為觀察指標(biāo)檢測Tets mRNA表達(dá)的變化。依據(jù)KCl濃度將細(xì)胞分為5組：對照組（0組），不同濃度KCl組（0.001、0.025、0.05、0.1 mmol/mL，分別標(biāo)記為0.001，0.025,0.05,0.1組）。結(jié)果 經(jīng)KCl刺激后，3個Tet mRNA在各組星形膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，但表達(dá)差異并不一致。其中Tet1 mRNA的表達(dá)總體升高，在0.05組達(dá)到高峰[0.05 vs.0,（6.854±0.980 9）vs.（1.000 0± 0.000 0），(P＜0.001)],此后回落；Tet2 mRNA的表達(dá)在各組間沒有顯著的變化(P＞0.05)；Tet3 mRNA的表達(dá)在0.001組有一個小幅升高，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義[0.001 vs.0，（1.358±0.439 8）vs.（1.000±0.000 0），(P＞0.05)]，此后在0.05組顯著升高[0.05 vs. 0，（2.621±0.160 8）vs.（1.000±0.000 0）P＜0.01]，此后回落。結(jié)論 KCl刺激可使人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Tet1和Tet3 mRNA的表達(dá)增高，其表達(dá)與KCl的濃度有關(guān)。

氯化鉀；星形膠質(zhì)細(xì)胞；Tet

2009 年Kriaucionis和Tahiliani等人[1-2]發(fā)現(xiàn)了生物體內(nèi)主動去甲基化關(guān)鍵酶——Tets蛋白的存在。Tet蛋白家族共有3個成員，分別為Tet1、Tet2和 Tet3，屬于α-酮戊二酸（α-KG)和Fe2+依賴的雙加氧酶。小鼠Tet1的缺失可以引起海馬長時間抑制；背側(cè)海馬過表達(dá)Tet1則會損傷記憶的形成。雖然Tet2也已在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些區(qū)域被發(fā)現(xiàn)[3]，但目前對Tet2與神經(jīng)病理學(xué)的發(fā)生發(fā)展仍不太清楚。已有研究關(guān)注Tet2在腫瘤發(fā)生及血液疾病調(diào)控中的作用：Tet2作為一種腫瘤抑制因子，能夠有效調(diào)控動物和人造血干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程[4-5]，這可能是Tet2在小鼠脊髓細(xì)胞中表達(dá)較少的原因。胚胎干細(xì)胞的Tet3缺失可以影響神經(jīng)元的分化；自閉癥患者則表現(xiàn)小腦Tet1和Tet3明顯增多[6]。Tets蛋白介導(dǎo)的DNA脫甲基化在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到非常重要的作用[7]。上述研究提示，Tet蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系。該研究于2017年2—4月，徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉重點實驗室調(diào)查了Tet家族的3個蛋白mRNA在不同濃度KCl誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化，每組3孔細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87)由該實驗室邢艷紅老師贈與，DMEM（Hyclone），胎牛血清（FBS）購自福麥斯生物科技有限公司，Trizol，反轉(zhuǎn)錄酶以及Real-time PCR試劑均購自Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞于DMEM完全培養(yǎng)基中 （含10% FBS）。將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞長滿皿底80%左右給予藥物干預(yù)。分別給予不同濃度KCl刺激細(xì)胞，KCl終濃度分別為：0.001、0.025、0.05、0.1 mmol/mL，分別標(biāo)記為：0.01,0.025,0.05,0.1組，對照組（0組），每孔加入500 μL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。藥物干預(yù)時間均為24 h。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

收集刺激好的細(xì)胞，用Trizol法抽提得到總RNA，用隨機引物oligo dT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。反應(yīng)條件：37℃，30 min，42℃，30 min。將cDNA凍存于-20℃。

1.4 Real-time PCR

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用特定引物進(jìn)行PCR擴增, PCR反應(yīng)采用10 μL反應(yīng)體系。所有引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。Tet1的上游引物：5'-CATCAGTCAAGACTTTAAGCCCT-3'，下游引物：5'-CGGGTGGTTTAGGTTCTGTTT-3'。Tet2的上游引物：5'-GATAGAACCAACCATGTTGAGGG-3'，下游引物：5'-TGGAGCTTTGTAGCCAGAGGT-3'，Tet3的上游引物：5'-GCCGGTCAATGGTGCTAGAG-3'， 下 游 引 物 ：5'-CGGTTGAAGGTTTCATAGAGCC-3'。反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5 min，94℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 15 s，45次循環(huán)，72℃延伸 10 min。內(nèi)參 GAPDH的上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。實驗中每個樣本重復(fù)3次，以Realtime PCR結(jié)果cp值為據(jù)，分析目的基因mRNA的相對表達(dá)量。mRNA相對含量分析使用2-△△CT法。同時以GAPDH作為內(nèi)參照。

2 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism v5.00軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并生成統(tǒng)計圖表。計量資料均采用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 KCl誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Tet1 mRNA表達(dá)變化的最適濃度

Real-time PCR檢測結(jié)果表明：與對照組（0）相比較KCl 0.05 mmol/mL（0.05）能夠顯著誘導(dǎo)Tet1 mRNA表達(dá)增高（P＜0.001）見表1、圖1。

表1 Real-time檢測Tet1 mRNA表達(dá)變化（±s）

表1 Real-time檢測Tet1 mRNA表達(dá)變化（±s）

注：各組分別與0組進(jìn)行比較 ***P＜0.001。

KCl濃度（mmol/mL）Tet1 mRNA表達(dá)0 0.001 0.025 0.05 0.1 1.000 0±0.000 0 0.827 4±0.109 8 1.622±0.636 0（6.854±0.980 9）***2.122±0.753 8

圖1 不同濃度的KCl對Tet1 mRNA表達(dá)的影響（n=3）與0組比較：＊＊＊P＜0.001

3.2 KCl誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Tet2 mRNA表達(dá)變化Real-time PCR檢測結(jié)果表明：KCl不同濃度組與0組相比較，Tet2 mRNA表達(dá)沒有明顯的變化。見表 2，圖2 。

表2 Real-time檢測Tet2 mRNA表達(dá)變化（±s）

表2 Real-time檢測Tet2 mRNA表達(dá)變化（±s）

KCl濃度 （mmol/mL）Tet2 mRNA表達(dá)0 0.001 0.025 0.05 0.1 1.000±0.000 0 0.745 1±0.190 9 0.755 1±0.183 5 1.226±0.023 71 0.869 9±0.869 9

圖2 不同濃度的KCl對Tet2 mRNA表達(dá)的影響（n=3）

3.3 KCl誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Tet3 mRNA表達(dá)變化的最適濃度

Real-time PCR檢測結(jié)果表明：與對照組（0組）相比較，KCl 0.01 mmol/mL（0.01組）Tet3 mRNA有一個小幅增長，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而0.05組Tet3 mRNA則顯著升高（**P＜0.01）見表3、圖3。

表3 Real-time檢測Tet3 mRNA表達(dá)變化（±s）

表3 Real-time檢測Tet3 mRNA表達(dá)變化（±s）

注：各組分別與0組進(jìn)行比較 **P＜0.01。

KCl濃度（mmol/mL）Tet3 mRNA表達(dá)0 0.001 0.025 0.05 0.1 1.000±0.000 0 1.358±0.439 8 0.930 0±0.275 7（2.621±0.160 8）**1.148±0.143 5

圖3 不同濃度的KCl對Tet3 mRNA表達(dá)的影響（n=3）與0組比較：＊＊P＜0.01。

4 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為數(shù)量最多、分布最廣、體積最大的一類膠質(zhì)細(xì)胞類型,廣泛分布于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng),并且在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的功能,參與認(rèn)知功能等大腦高級活動[8]。近年來,研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過細(xì)胞表面的受體,如清道夫受體[9]、Toll樣受體[10]及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,產(chǎn)生和釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)。有證據(jù)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠維持腦內(nèi)平衡以及神經(jīng)細(xì)胞的代謝[11]，在腦損傷中具有重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種損傷都能刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖，如病理損傷、化學(xué)性刺激和疾病等[12]。近日，羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心生物研究人員發(fā)現(xiàn)，移植人類的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能夠增強小鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力，說明這類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在人類認(rèn)知中具有重要作用。這項新研究中指出，在進(jìn)化過程中人類的星形膠質(zhì)細(xì)胞變得更大更復(fù)雜，賦予了人類大腦更大的復(fù)雜性，幫助人類最終進(jìn)化出獨有的高認(rèn)知能力[13]。而維持細(xì)胞外鉀濃度的平衡是星形膠質(zhì)細(xì)胞非常重要的功能。神經(jīng)元興奮時釋放大量的鉀,如果星形膠質(zhì)細(xì)胞緩沖細(xì)胞外鉀的能力下降,則細(xì)胞外的鉀明顯增加,從而加重驚厥的發(fā)生和發(fā)展。該研究首次觀察了高濃度鉀對星形膠質(zhì)細(xì)胞Tets基因表達(dá)的影響。

在該研究中顯示,在給予高濃度鉀后，Tet1和Tet3基因mRNA都有明顯的上調(diào)，其中Tet1基因在0.05組表達(dá)最高 （6.854±0.980 9），Tet3基因也是在0.05組達(dá)到高峰（2.621±0.160 8），而Tet2基因卻沒有顯著的變化，這說明Tet1和Tet3基因和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系，而Tet2雖然在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些區(qū)域表達(dá)亦十分豐富，但其對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的病理生理調(diào)控過程仍不清楚。這和Zhiqiang Pan等[14-15]的研究結(jié)果有相似之處(急性炎性痛和慢性炎性痛兩種模型中小鼠Tet1和Tet3 mRNA與對照組相比明顯增多，Tet1：[急性痛 vs.對照組，（20.31± 1.15）vs.（22.88±0.12），(**P＜0.01)]，[慢性痛vs.對照組，（22.28±0.19）vs.（23.72±0.08），(**P＜0.01)]；Tet3：[急性痛vs.對照組，（20.47±0.98）vs.（22.02±0.29），(*P＜0.05)，慢性痛 vs.對照組，（22.43±0.06）vs. （23.46±0.05），(**P＜0.01)]（Real-time PCR結(jié)果cp值的表達(dá)變化，cp值越小，基因mRNA表達(dá)越高），這提示Tet1和Tet3均參與了福爾馬林誘導(dǎo)的急性炎性痛和CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛，均參與了神經(jīng)元敏化和疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程，而Tet2變化卻并不顯著)。

高濃度 KCl刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞 Tet1和 Tet3基因mRNA均明顯增高，這對于治療某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病可起提示作用，若對Tet1和Tet3蛋白的調(diào)制進(jìn)行深入研究，對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療將會有深遠(yuǎn)的意義。

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Effect of Potassium Chloride Solutions Stimulation Glial Fibrillary Acidic Protein on the Tets Gene Expression

HAO Ling-yun,WANG Qin-yue,SUN Meng-lan,PAN Zhi-qiang
Key Laboratory of Anesthesiology,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu Province,22100 China

Objective To observe the effects of different concentrations of potassium chloride solutions stimulation glial fibrillary acidic protein on the Tets gene expression.Methods The key laboratory of anesthesia in Xuzhou Medical University was selected from February to April 2017,and the U87 cell was stimulated by different concentrations of KCl,and the total RNA was extracted by the Trizol, and the changes of Tets mRNA expressin were tested by taking the Real-time PCR test results as the observation indexes and the cells were divided into five groups according to the KCl concentration,including the control group (0 group)and different concentrations of KCl groups(0.001，0.025，0.05，0.1 mmol/mL),respectively marked as 0.001，0.025,0.05,0.0 groups.Results After the KCl stimulation,3 Tet mRNA had the expression in astrocytes in various groups,but the difference in expression was inconsistent,and the total expression of Tet1 mRNA increased and the expression in 0.05 group reached the peak[0.05 vs.0,（6.854±0.980 9）vs.（1.000 0± 0.000 0）(P＜0.001)],and then decreased,and the expression of Tet2 mRNA in each group had no obvious changes（P>0.05）,and the expression of Tet3 mRNA in the 0.001 group had a small increase,but without statistical significance[0.001 vs.0，（1.358±0.439 8）vs.（1.000±0.000 0），P＞0.05],and the expression in 0.05 group obviously increased[0.05 vs.0，（2.621±0.160 8）vs.（1.000±0.0000），(P＜0.01)]and then decreased.Conclusion KCl can increase the expressions of Tet1 and Tet3 mRNA in the human brain glioblastoma cells and the expression is related to the KCl concentration.

Potassium chloride;Astroglia cell;Tet

R741

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.03

2017-06-08；

2017-06-23

國家自然科學(xué)基金面上項目 （81671096）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上（16KJB320014）；徐州醫(yī)科大學(xué)2014年度江蘇省重點實驗室開放課題（JSBL1404）。

郝凌云（1978-），女，江蘇徐州人，碩士，實驗師，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

潘志強（1974-），男，安徽淮北人，博士，教授，研究方向：疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，E-mail：307577660@qq.com。