HER2腫瘤靶向親合體重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)純化及功能驗(yàn)證

池小琴

福建省廈門市廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝膽實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361004

HER2腫瘤靶向親合體重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)純化及功能驗(yàn)證

池小琴

福建省廈門市廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝膽實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361004

目的 實(shí)現(xiàn)重組親合體的高效表達(dá)和純化，并驗(yàn)證其活性。 方法 選擇2016年1—12月該院收治的56例卵巢癌患者為研究對(duì)象，對(duì)HER2親合體編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，增加其與納米載體的連接位點(diǎn)，提高表達(dá)和純化效率。重組表達(dá)產(chǎn)物ZHER2:342經(jīng)過(guò)凝膠親和層析純化和質(zhì)譜檢測(cè)分子量，并將純化產(chǎn)物作為靶向分子連接納米藥物，檢測(cè)其對(duì)HER2高表達(dá)細(xì)胞的靶向能力。結(jié)果 ZHER2:342重組親合體產(chǎn)物純度約為97.8%，回收效率1.0 mg/mL。純化產(chǎn)物分子量為7.648 kDa，與理論值7.631 kDa誤差0.2%，表明構(gòu)建的Cys-ZHER2:342-6His重組親合體正確。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明其可顯著提高納米藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性（P＜0.01），對(duì)HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有特定的靶向性。結(jié)論 重組表達(dá)產(chǎn)物ZHER2:342構(gòu)建正確，可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)純化并對(duì)HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有特定的靶向性。

腫瘤；靶向分子；重組親合體；表達(dá)純化；靶向能力分析

親合體是通過(guò)定向分子進(jìn)化技術(shù)篩選獲得的一類新型的獨(dú)特的蛋白結(jié)合配體，親合體的結(jié)合位點(diǎn)與抗體相似且親和力強(qiáng)；分子量小，不易在體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答，組織穿透性好；性質(zhì)十分穩(wěn)定[1]。

親合體的這些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)引起了科研工作者的關(guān)注，研究人員利用HER2親合體ZHER2作為HER2高表達(dá)腫瘤疾病（宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）的特定靶向配體[2-5]。目前，將親合體ZHER2:342作為靶向分子進(jìn)行靶向腫瘤能力的研究中，親合體主要是通過(guò)化學(xué)合成獲得的[6-7]。但化學(xué)合成親合體的方法成本較高，且雜質(zhì)多，不易純化。

該文對(duì)重組親合體的編碼序列按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行堿基優(yōu)化,并在序列中添加腸激酶酶切位點(diǎn)、半胱氨酸密碼子、6His-Tag純化標(biāo)簽等序列,增加重組親合體與納米載體的連接位點(diǎn)，并保證表達(dá)產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，提高了表達(dá)和純化效率,降低了生產(chǎn)成本；該文還通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了表達(dá)產(chǎn)物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的特定靶向能力。對(duì)2016年1—12月該院收治的56例卵巢癌患者進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證，現(xiàn)將內(nèi)容總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ATO購(gòu)于北京華奉聯(lián)博科技有限公司，氨芐青霉素、IPTG、腸激酶rEK、透析袋、FITC等購(gòu)于上海生工。交聯(lián)劑MAL-NHS、NAP-10凝膠柱、Superdex 75 10/300 GL凝膠柱、HisTrap HP預(yù)裝柱購(gòu)于GE公司。所有細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 重組靶向親合體的構(gòu)建

1.2.1 重組親合體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將HER2親合體的核苷酸序列進(jìn)行了重組優(yōu)化設(shè)計(jì)，在序列前端加上BamHⅠ酶切位點(diǎn)、腸激酶酶切位點(diǎn)和半胱氨酸殘基，后端加上6His-Tag純化標(biāo)簽和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，方便表達(dá)產(chǎn)物的分離純化及與納米顆粒的連接（圖1）。并將重組親合體Cys-ZHER2:342-6His（以下簡(jiǎn)寫為 ZHER2:342）的核苷酸序列按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行堿基優(yōu)化，優(yōu)化后的序列

CATCATTAATAGCTCGAG下劃線部分為HER2親合體的編碼序列）送上海生工合成，由于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 重組親合體ZHER2:342的核苷酸序列示意圖

重組親合體ZHER2:342基因片段與pET32a(+)表達(dá)型質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切連接，構(gòu)建重組親合體表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)-ZHER2:342，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切結(jié)果驗(yàn)證。

1.2.2 利用大腸桿菌表達(dá)重組親合體ZHER2:342制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，獲得胞內(nèi)可溶性表達(dá)產(chǎn)物，用Tricine SDS-PAGE電泳驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.3 重組親合體ZHER2:342的純化方法 超聲破碎后的上清液經(jīng)快速蛋白液相色譜 （Fast protein liquid chromat ography，F(xiàn)PLC）純化，純化柱用HisTrap HP預(yù)裝柱（GE），得到融合蛋白Trx-ZHER2:342。

將融合蛋白于4℃下透析；再用腸激酶rEK酶切12～24 h；最后用Superdex 75 10/300 GL凝膠柱(GE)層析分離得到目標(biāo)產(chǎn)物：重組親合體ZHER2:342。蛋白含量采用BCA方法測(cè)定。最終純化產(chǎn)物用低溫真空冷凍干燥獲得重組親合體ZHER2:342的凍干粉，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組親合體ZHER2:342的鑒定及靶向能力分析

取少量重組親合體ZHER2:342純化產(chǎn)物置于透析袋中，用蒸餾水透析；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）測(cè)定純化產(chǎn)物的精確分子量。

將1 nM HSNs（介孔空心SiO2納米顆粒）先與1 μM MAL-NHS在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中均勻混合，并于室溫下緩慢攪拌2 h，凝膠柱（NAP-10，GE）除去未結(jié)合的小分子；再加入0.1 μM ZHER2:342繼續(xù)攪拌使親合體與納米藥物連接，用NAP-10凝膠柱純化，獲得HSNs-ZHER2:342納米顆粒。將熒光分子FITC與HSNs表面的氨基反應(yīng)，獲得HSNs-FITC、HSNs-FITC&ZHER2并將它們分別與兩種不同的細(xì)胞株 SKOV3（HER2高表達(dá)細(xì)胞株）、SMMC7721（HER2低表達(dá)細(xì)胞株）孵育24 h，流式細(xì)胞分析比較納米顆粒進(jìn)入不同細(xì)胞的數(shù)量差異。

圖2 重組親合體ZHER2:342的構(gòu)建及表達(dá)純化

1.4 Ni,As@SiO2-ZHER2:342靶向納米藥物的合成

通過(guò)斯托伯格法制備Ni,As@SiO2納米顆粒[9]。并采用交聯(lián)劑MAL-NHS將靶向親合體與納米藥物Ni,As@SiO2偶聯(lián)，形成表面帶有靶向親合體的納米藥物：Ni,As@ SiO2-ZHER2:342。具體方法同1.3。通過(guò)反應(yīng)前后納米藥物表面zeta電位的改變判定靶向分子是否已經(jīng)連接到了 Ni, As@SiO2納米藥物的表面。將制備好的靶向納米藥物重懸于PBS緩沖液便于后續(xù)體內(nèi)外生物實(shí)驗(yàn)。

1.5 納米藥物的細(xì)胞毒性檢測(cè)

SKOV3細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS,Hyclone)的Mc-Coy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，SMMC7721細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS,Hyclone)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。MTT法研究新型納米藥物與卵巢癌細(xì)胞的特異靶向能力。測(cè)定不同藥物對(duì)癌細(xì)胞的IC50，分析不同藥物對(duì)癌細(xì)胞的毒性差異，驗(yàn)證納米藥物的選擇性殺傷力。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Student’s t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2重組親合體ZHER2:342的構(gòu)建及表達(dá)純化

HER2重組親合體ZHER2:342基因片段由經(jīng)人工合成后連接到pET32a(+)表達(dá)型質(zhì)粒上，經(jīng)酶切檢測(cè)大小正確（圖2A、2B）。將重組質(zhì)粒pET32a-ZHER2:342導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可高效表達(dá) ZHER2:342的重組菌BL21(DE3)-pET32a-ZHER2:342。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可溶性表達(dá)融合蛋白Trx-ZHER2:342。

重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET32a-ZHER2:342的表達(dá)產(chǎn)物含有6His-tag純化標(biāo)簽，因此用快速蛋白質(zhì)液相層析系統(tǒng)（FPLC，GE）結(jié)合鎳柱親和層析可初步純化融合蛋白Trx-ZHER2:342，純化后的融合蛋白用腸激酶切除前端Trx蛋白，再經(jīng)凝膠分離得到最終產(chǎn)物：重組親合體 ZHER2:342（圖2C）。取少量ZHER2:342純化產(chǎn)物置于透析袋中，用蒸餾水透析；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）測(cè)定產(chǎn)物的精確分子量。得出結(jié)果ZHER2:342重組親合體產(chǎn)物純度均為97.8%，回收效率1.0 mg/mL。取2 μL透析后樣品與1 μL基質(zhì)混勻后上樣，測(cè)得純化產(chǎn)物的分子量為7.648 kDa（圖2D），與ZHER2:342的理論值7.631 kDa，誤差0.2%，表明構(gòu)建的Cys-ZHER2:342-6His重組親合體正確。

2.2 重組親合體ZHER2:342靶向卵巢癌細(xì)胞的特異性分析

通過(guò)熒光分子FITC驗(yàn)證合成的重組親合體 ZHER2:342是否具有特異的靶向能力。選擇 HER2低表達(dá)的SMMC7721細(xì)胞和HER2高表達(dá)的SKOV3細(xì)胞做對(duì)比，將這3種細(xì)胞分別與HSNs-FITC、HSNs-FITC&ZHER2納米粒子孵育24 h，結(jié)果顯示相同納米顆粒濃度和相同孵育時(shí)間下，與HSNs-FITC&ZHER2共同孵育的SKOV3細(xì)胞其熒光信號(hào)比SMMC7721的強(qiáng)，證明ZHER2:342對(duì)HER2高表達(dá)的癌細(xì)胞具有特異靶向能力（圖3）。

圖3 重組親合體ZHER2:342對(duì)HER2高表達(dá)的癌細(xì)胞有靶向能力。A：SMMC7721；B：SKOV3。

2.3 靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對(duì)卵巢癌細(xì)胞的毒性更強(qiáng)

將自主合成的Ni,As@SiO2納米藥物與ZHER2:342重組親合體分子通過(guò)交聯(lián)劑MAL-NHS偶聯(lián)（圖4A），用凝膠柱（NAP-10）純化，獲得靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定靶向修飾前后納米藥物的表面電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Ni,As@SiO2表面電位為30.2 mV，連接靶向分子后Ni,As@SiO2-ZHER2:342的表面電位降為5.2 mV。這是由于重組親合體的等電點(diǎn)PI為6.17，在水溶液中顯負(fù)電，因此將其連接到納米藥物上后，降低了其表面電位。靶向前后表面電位的差異證明重組親合體已經(jīng)成功連接到了納米顆粒上。

對(duì)合成的靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342進(jìn)行細(xì)胞毒性和特異靶向能力的分析。MTT法測(cè)定不同藥物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721和卵巢癌細(xì)胞SKOV3的細(xì)胞毒性 （24 h，圖4B、4C）。納米藥物Ni,As@SiO2和ZHER2:342靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對(duì)SKOV3的IC50分別為（10.42±1.85）、（6.25±1.21）μM，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而這兩種納米藥物對(duì)SMMC7721的IC50分別為（8.33±0.81）、（7.5±0.73）μM。重組親合體靶向修飾后的納米藥物比未修飾納米藥物對(duì)HER2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而在HER2低表達(dá)的肝癌細(xì)胞SMMC7721中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明ZHER2:342重組親合體對(duì)HER2過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有特定的靶向效果，提高了藥物對(duì)其抗癌活性。

3 討論

圖4 靶向分子增強(qiáng)了納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對(duì)卵巢癌SKOV3的細(xì)胞毒性

隨著現(xiàn)代納米生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于納米技術(shù)的靶向性輸送體系有望實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)腫瘤診斷和治療方法所無(wú)法企及的高效、低毒的效果，成為腫瘤診斷和治療的有效手段之一。靶向分子是構(gòu)建靶向性輸送體系的重要因素，親合體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)決定了其可作為高親和力靶向分子連接到納米載體上，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向[9-10]。

Rosik D等[7]采用微波輔助的固相肽合成方法（microwaveassisted solid-phase peptidesynthesis）合成HER2親合體，回收效率僅70%，而該研究對(duì)HER2親合體ZHER2:342的編碼序列進(jìn)行重組優(yōu)化設(shè)計(jì)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了其高效表達(dá)和純化，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)量；并增加了其與納米載體的連接位點(diǎn)，使其易于實(shí)現(xiàn)納米載體的靶向功能化，便于探索其各種潛在應(yīng)用，包括腫瘤靶向成像和靶向治療，為后續(xù)的開(kāi)發(fā)研究奠定了重要基礎(chǔ)。該研究還表明將ZHER2:342重組親合體與砷納米藥物連接，在卵巢癌中可實(shí)現(xiàn)高的特定靶向能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前已有的研究相同，有報(bào)道將ZHER2:342親合體與不同SPECT顯影劑，在卵巢癌中均能實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的特定顯影能力[9-11]。該研究所構(gòu)建的靶向納米藥物Ni,As@SiO2-ZHER2:342對(duì)卵巢癌細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，這可能是由于ZHER2:342重組親合體與卵巢癌SKOV3表面的HER2具有高度親和力，靶向納米藥物富集在SMMC7721細(xì)胞表面，更易被細(xì)胞攝取進(jìn)入胞內(nèi)溶酶體中，再緩慢釋放出As離子，進(jìn)而有效殺死腫瘤細(xì)胞。以上研究結(jié)果表明構(gòu)建的重組親合體ZHER2:342可作為高親和力的靶向分子與目標(biāo)分子、納米藥物或探針連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的靶向功能化，后續(xù)將對(duì)所構(gòu)建的靶向納米藥物對(duì)HER2高表達(dá)的不同癌細(xì)胞都進(jìn)行研究比較，以驗(yàn)證重組親合體ZHER2:342的特定靶向性。

該文建立了重組親合體ZHER2:342的高效表達(dá)和純化方法，并證實(shí)了它的有效生物活性，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，為其進(jìn)一步的應(yīng)用開(kāi)發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化研究提供了保障。

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Construction,Expression and Purification and Functional Verification of HER2 Tumor Target Affinity Recombinant Protein

CHI Xiao-qin
Hepatobiliary Laboratory,Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University,Xiamen,Fujian Province,361004 China

Objective To realize the high efficient expression and purification of recombinant affinity and test its activity.Methods 56 cases of patients with oophoroma admitted and treated in our hospital from January to December 2016 were selected and the HER2 affinity coding sequence was optimized and the connection site with nanocarrier was enhanced,and the expression and purification efficacies were improved and the recombinant expression product ZHER2:342was purified by the gel affinity chromatography and molecular weight was tested by the mass spectrum,and the purification products were used as the targeting molecules to connect the nanodrugs,and the targeting ability of it to the HER2 high-expression cells was tested.Results The pure of ZHER2:342recombinant affinity product was about 97.8%and the recycle efficacy was 1.0 mg/mL,and the molecular weight of purification products was 7.648 kDa, and the error was 0.2%compared with the theoretical value 7.631 kDa,which shows that the construction of Cys-ZHER2:342-6His recombinant affinity was correct,and the cell test showed that it could obviously improve the cytotoxicity of nano-drugs to breast cancer cells（P<0.01）,and it had a specific target to the tumor cells with high HER2 high-expression.Conclusion The construction of recombinant expression product of ZHER2:342is correct,which can realize the high-efficiency expression and purification and has a certain target to the tumor cells with high HER2 high-expression.

Tumor;Targeting molecule;Recombinant affinity;Expression and purification;Targeting ability analysis

R14

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.06

2017-06-02；

2017-06-20

本論文受廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20164024,3502Z20144019）；福建省自然科學(xué)基金青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目（2013D014）。作者簡(jiǎn)介：池小琴（1983-），福建三明人，碩士，助理研究員，研究方向：納米醫(yī)學(xué)。