丙氨酸對林可霉素發酵的影響

孫玉杰，楊淑慎，張 琪，武 培，魏 娟

(1.西北農林科技大學,陜西 楊凌 712100;2.天方藥業有限公司,河南 駐馬店 463000)

丙氨酸對林可霉素發酵的影響

孫玉杰1,2，楊淑慎1*，張 琪2，武 培2，魏 娟2

(1.西北農林科技大學,陜西楊凌712100;2.天方藥業有限公司,河南駐馬店463000)

在林可鏈霉菌發酵產林可霉素的過程中添加丙氨酸有利于林可霉素的生物合成。在搖瓶發酵過程中，于發酵開始24h向發酵培養基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效價提高了15%；放大至15L發酵罐，成功驗證了丙氨酸對林可霉素生物合成的促進作用，發酵罐放罐效價達5300U/mL,比對照罐效價提高了20%。通過檢測發酵液中的丙酮酸發現，丙酮酸可能抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸轉化，使菌體內積累高濃度磷酸烯醇式丙酮酸，進而提高林可霉素的產量。

林可鏈霉菌；丙酮酸激酶；丙氨酸

林可霉素(Lincomycin)具有較好的抗革蘭陽性菌的能力，它與已知的抗生素間不存在交叉耐藥性，并且毒性很低、抗菌活性更強，因此林可霉素和它的衍生物鹽酸林可霉素已經廣泛用于醫療衛生行業[1]。林可霉素是在美國林肯市的土壤中發現的由林可鏈霉菌林可變種所產生的一類能抑制細菌的蛋白質合成，對大多數革蘭陽性菌和某些厭氧的革蘭陰性菌有抗菌作用的抗生素。在林可霉素發酵生產過程中除主要產生林可霉素A組分外，還伴有少量的林可霉素B組分。林可霉素及其下游半合成產品稱為林肯酰胺類抗生素。林肯酰胺類抗生素已成為臨床應用上主要的抗生素之一[2]。

目前國內外學者對林可霉素的生物合成進行了多方面優化研究，當然也取得了一定成果。例如：周曉芳等[3]用棉籽蛋白粉和花生粉替代林可鏈霉菌培養基中的黃豆餅粉，用響應面分析法優化了林可鏈霉菌的發酵培養基，用優化后的發酵培養基培養林可鏈霉菌，林可霉素的產量提高了12%～17%。李嘯等[4]人在林可鏈霉菌的發酵培養基中添加氨基酸和生物素，使林可霉素的產量提高了42%。湯海云等[5]人在林可鏈霉菌的發酵培養基中添加了不同濃度、不同種類的金屬離子，使林可霉素的產量提高了20%。

本文通過搖瓶發酵培養考察不同濃度的丙氨酸、丙氨酸不同添加時間對林可霉素產量的影響，并擴大到15L發酵罐進行驗證，同時檢測發酵液中丙酮酸的濃度，以明確丙氨酸對林可霉素生物合成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用菌種

Js0215-03F1

1.1.2 培養基

種子培養基(%)

玉米淀粉2，黃豆餅粉(生)2，葡萄糖1，玉米漿4，(NH4)2SO40.2，CaCO30.4，pH值:6.8。

發酵培養基(%)

黃豆餅粉(生)2.5，葡萄糖12，玉米漿0.4，(NH4)2SO40.8，NaCl 0.8， K2HPO40.025，NaNO30.6，CaCO30.8，pH值:7.2。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

1.2.1.1 搖瓶培養

搖瓶種子培養：挖斜面培養基1cm2左右的菌塊，接種到裝有50mL種子培養基的500mL的三角瓶中，29℃條件下，230 r/min搖床振蕩培養48h。

搖瓶發酵培養：將培養好的種子液按10%的接種量移種到裝有30mL發酵培養基的250mL的三角瓶中，29℃條件下，230r/min搖床振蕩培養7d。

1.2.1.2 15L發酵罐培養

發酵罐所需要的一級種子培養方法和搖瓶種子培養方法相同，二級種子培養24h。

將二級種子液以10%的接種量接入裝有發酵培養基的15L發酵罐中。控制好發酵溫度29℃，轉速120r/min，風量：0.5vvm。發酵24h起每隔4h補一次料，以滿足發酵過程中菌種對營養物質的需求。

1.2.2 丙氨酸對發酵培養基中林可霉素產量的影響

1.2.2.1 搖瓶發酵培養基中丙氨酸最適添加濃度的確定

在搖瓶發酵開始0h時分別向發酵培養基中添加濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的丙氨酸作為實驗組，以不添加丙氨酸的作為對照組，進行放瓶搖瓶中林可霉素含量的測定，對比放瓶效價，來確定搖瓶發酵培養中丙氨酸的最適添加濃度。

1.2.2.2 搖瓶發酵培養基中丙氨酸最適添加時間的確定

在發酵搖瓶中分別于24,48,72,96,120h和144h添加0.02%的丙氨酸作為實驗組，以不添加丙氨酸的作為對照組，進行放瓶效價的比較，以確定發酵搖瓶培養基中丙氨酸的最適添加時間。

1.2.2.3 15L發酵罐進行不添加丙氨酸(對照組)和在發酵24h添加濃度為0.02%的丙氨酸(實驗組)的發酵培養，一定發酵時間取樣，通過比較放罐效價以及發酵過程中丙酮酸的含量變化，進一步確定丙氨酸對林可霉素合成的影響。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 生物效價

生物效價的測定方法：見中國藥典[6]。

1.2.3.2 丙酮酸的測定

采用高效液相色譜法檢測發酵液中丙氨酸濃度。

2 結果與分析

2.1 不同濃度丙氨酸對林可霉素產量的影響

中日醫院呼吸中心煙草病學與戒煙中心主任肖丹教授說，雖然理論上電子煙的危害應比普通卷煙略小，但依然含有尼古丁、丙二醇、丙三醇、重金屬等有害物質，會增加患慢性阻塞性肺疾病、肺癌、心血管疾病的風險，只要接觸人體就會帶來安全隱患。

在發酵開始時向發酵搖瓶培養基中加入不同濃度的丙氨酸，考察林可霉素產量的變化，具體結果見圖1。

圖1 添加不同濃度丙氨酸對林可霉素合成的影響

從圖1可知，在搖瓶發酵0h時，當丙氨酸的添加濃度為0.02%時，林可霉素搖瓶發酵效價達到了4210U/mL，比對照組效價提高了20%，可能原因是只有在丙氨酸的添加濃度合適的情況下，才會對林可霉素的效價產生正影響。

2.2 丙氨酸不同添加時間對林可霉素效價的影響

在搖瓶發酵培養基中分別在發酵的不同時間點添加0.02%的丙氨酸，以不添加丙氨酸的作為對照，發酵結束后，搖瓶效價測定結果如圖2所示。

圖2 在不同時間添加丙氨酸對林可霉素效價的影響

從圖2可以看出，當24h添加一定濃度的丙氨酸時，其效價達到3950U/mL,比對照組的3400U/mL提高了15%。可能原因是在發酵24h時，丙氨酸抑制磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化，從而提高林可霉素的效價。

2.3 15L發酵罐中添加丙氨酸對林可霉素效價的影響

前期搖瓶實驗證明，在搖瓶發酵過程中，于發酵24h向發酵培養基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效價提高了15%。以此濃度和添加時間為基點放大至15L發酵罐，分析放罐效價，進一步確定丙氨酸對林可霉素合成的影響。實驗結果如圖3所示。

圖3 15L發酵罐中添加丙氨酸對林可霉素效價的影響

圖3表明，當向發酵培養基中添加了丙氨酸之后，林可霉素的效價有了明顯提高，放罐效價達到5300U/mL,比沒有添加丙氨酸的對照罐提高了20%。

2.4 15L發酵罐中添加丙氨酸對丙酮酸含量的影響

15L發酵罐發酵培養林可霉素時，按一定時間點取樣，采用高效液相色譜法測定發酵液中丙酮酸的含量。實驗結果如圖4所示。

圖4 丙酮酸在發酵過程中含量的變化

圖4可以看出，在發酵中后期，處理組和對照組的丙酮酸含量有明顯的差異，可能是因為，添加了丙氨酸的處理組抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化，才會使得發酵過程中丙酮酸的積累量相對于對照組降低。

3 結論

在搖瓶發酵過程中，于發酵開始時24h向發酵培養基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的搖瓶效價提高15%，放大至15L發酵罐，驗證了發酵培養過程中添加丙氨酸可大幅度提高林可霉素的效價，使得放罐效價達到5300U/mL,比對照罐效價提高了20%。同時采用高效液相色譜法檢測發酵液中丙酮酸的含量，發現丙氨酸作為林可霉素代謝途徑中關鍵酶的抑制劑，能夠對林可霉素的合成產生重要影響。

[1] 丁 琳.復合誘變選育林肯霉素高產菌株[J].基酸和生物資源，2006，28(4)68-70.

[2] Wright J L C.The lincomycin-celesticetin-anthramycin group[M]// Vining L C .Biochemistry and Genetic Regulation of Commercially Important Antibiotics, London: Addison-Wesley Publishing Company ,1983.

[3] 周曉芳，葉蕊芳，儲成亮,等林可霉素生物合成培養基的優化[J].工業微生物，2011，41(2)：21-25.

[4] 李 嘯，儲 矩，張嗣良,等.生物素和氨基酸對林可霉素生物合成的影響[J]中國抗生素雜志，2008，33(1)：6-10.

[5] 湯海云，李 嘯，儲 矩,等.金屬離子對林可霉素合成的影響[J].中國抗生素雜志，2007，32(12)：723-726.

[6] 國家藥典委員會.ChP 中國藥典(二部)[M].北京：中國醫藥科技出版社, 2010.

(本文文獻格式：孫玉杰，楊淑慎，張琪，等.丙氨酸對林可霉素發酵的影響[J].山東化工，2017，46(16)：9-10,12.)

The Effect of Alanine on the Fermentation of Lincomycin

Sun Yujie1,2，Yang Shushen1*，Zhang Qi2，Wu Pei2，Wei Juan2

(1 .Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2 .Topfond Pharmaceutcal Co.,Ltd., Zhumadian 463000, China)

This topic is mainly used in the process of lincomycin, which can be used to make the biosynthesis of lincomycin. During the fermentation process, the effect price of lincomycin was increased by 15% by adding 0.02% of alanine to the fermentation medium during the fermentation period. It was amplified to 15L starter, successfully validating the effect of alanine on the biosynthesis of lincomycin, and the efficiency of the pot was up to 5300U/mL, which was 20% higher than that of the control pot.Pyruvic acid in the fermented liquid through testing found that pyruvate may inhibit the pyruvate kinase in the glycolytic pathway of enzyme activity, thus inhibiting the enol phosphate type pyruvate to pyruvic acid, make the bacteria in the body accumulation of high concentrations of enol phosphate type pyruvic acid, and improve the output of lincomycin.

streptomyces lincolnensis; pyruvate kinase;alanine

TQ465

：A

：1008-021X(2017)16-0009-02

2017-06-16

陜西省社會發展科技攻關項目(2015SF308，野生名貴植物紅豆杉產天然抗癌藥物紫杉醇的研究)

孫玉杰(1986—)，女，河南駐馬店人，主要從事林可霉素、紅霉素等菌種選育的研究；通訊作者：楊淑慎(1956—)，女，西北農林科技大學生命科學院學院教授，博士，博士生導師，九三學社社員，主要從事植物抗逆生理、植物細胞培養工程方面的研究工作。