發酵天龍粉中總多糖的含量測定方法研究

張由芹，王 穎，朱明珠，王集會

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學實驗中心，山東 濟南 250355 )

發酵天龍粉中總多糖的含量測定方法研究

張由芹1，王 穎1，朱明珠1，王集會2

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355；2.山東中醫藥大學實驗中心，山東濟南250355 )

[目的] ：創建發酵天龍粉中多糖含量測定方法。[方法]：發酵天龍粉中的多糖的提取采用超聲水提取的方法，發酵天龍粉多糖的含量的測定采用紫外分光光度法。[結果] ： 測得發酵天龍粉中多糖含量為13.4628 mg/g，相對標準誤差(RSD)為4.19%(n=5)[結論]： 發酵天龍粉多糖的含量的測定采用紫外分光光度法，不僅操作簡單，而且準確度高，可用來測定天龍粉中多糖的含量。

發酵天龍粉；總多糖；含量測定；超聲水提取法；紫外分光光度法

壁虎科蹼趾壁虎(Gekko Chinensis Groy),或同屬它科壁虎的干燥體，亦名守宮、天龍，廣東地區又稱其為"鹽蛇"。江、浙、皖等省均有產。味咸，性寒，有小毒。入心、肝二經[1]。具有祛風定驚、止咳平喘、解毒散結、通絡止痛等功效，臨床常用于非小細胞肺癌、肝癌、胃腸道癌等惡性腫瘤的治療，療效確切[2]。多糖(polysaccharides,PS)是由10個以上的單糖聚合而成的生物高分子，多糖包含均多糖(homosaccharide)和雜多糖(heterosaccharide),前者是由同一單糖組成，后者則是兩種以上不同的單糖組成[3]。近年來，針對中藥多糖的藥理活性研究成為熱點，已經證實中藥多糖具有促進免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗應激、抗輻射及抗衰老等多種生物活性，對促進機體特異性免疫與非特異性免疫都有廣泛的影響[4]。糖的定量、定性測定是糖研究的一個重要基礎工作[5]。目前，國內植物多糖的提取較多，對于蟲類中多糖的提取和含量的測定的報道較少，為此，筆者通過超聲水提取的方法進行提取，紫外分光光度計法測定其含量，效率較高，成本低，這為今后蟲類中總多糖的研究具有一定的意義。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；LDZ4-0.8型離心機(北京醫用離心機廠)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV9100B型可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 試劑

吐溫-80、化學對照品蘆丁( 中國醫藥上海化學試劑公司)、苯酚、濃硫酸、 D-無水葡萄糖為分析純，所用水為重蒸水。

1.3 藥材

天龍購自安徽亳州，經山東中醫藥大學生藥系高德民老師鑒定為無蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther。發酵天龍粉，批號20150801，由山東中醫藥大學實驗中心化學實驗室自制。白僵菌孢子粉(100億/g,山東省農業科學院植物保護研究所自篩菌株——桃5)。

2 方法與結果

2.1 發酵天龍粉的制備

稱取(精確稱量)定量干燥的天龍粉，然后取1.00 g白僵菌孢子粉，加入少量定量的吐溫-80，用滅菌水稀釋成為每毫升含1×108個孢子的混懸液，取其適量，然后拌勻潤濕，在25～28 ℃，濕度為95 %的條件下，恒溫恒濕培養箱中發酵8天左右，待長滿菌絲后停止發酵。

2.2 發酵天龍粉中總多糖供試品溶液的制備

取發酵天龍粉約0.5 g，精密稱定，置于50 mL燒杯中，按料液比1:30加入15 mL蒸餾水，超聲提取10 min,抽濾，保留殘渣，共浸提三次。將抽濾后的上清液合并，定容至50 mL，即為測總多糖的供試品溶液。

2.3 總多糖含量的測定

2.3.1 標準葡萄糖溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10.00 mg，放置在燒杯中，加適量水溶解，然后轉移至100 mL容量瓶中，加水至刻度線，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL葡萄糖溶液。

2.3.2 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0,1,1.5,2,2.5,3 mL分別置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，分別量取2 mL置15 mL具塞試管中，然后再精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，充分搖勻，放置1 0min，然后置于40℃水浴中保溫15 min，取出,冷卻至室溫。搖勻后，在490 nm波長處測定各樣品吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到的線性回歸方程為：Y=15.06X+0.004,r=0.9990，范圍為 0～0.03 mg/mL 。

2.3.3 精密度試驗

精確吸取已制備好的測總多糖的樣品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容，重復取樣5次，每次2 mL，用紫外可見分光光度法在波長 510 nm下連續5次測定吸光值，吸光度分別為0.4268 、0.4292 、0.4286、0.4282、0.4297，相對標準誤差RSD=0.26%(n=5)，結果表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗

精確吸取已制備好的測總多糖的樣品液2 mL于10 mL容量瓶中，定容， 每次取稀釋好的的試樣液2 mL，用紫外分光光度計測定其在2、4、6、8、10 h的吸光值，吸光度分別為0.4192 、0.3893 、0.4178 、0.3835 和0.3892結果在10 h多糖含量的相對標準誤差RSD=4.31%(n=5)，結果表明該方法穩定性較好。

2.3.5 重復性試驗

準確稱取發酵天龍粉樣品5份,每份約0.5 g，按“2.3.2”項下方法進行提取和制備溶液,重復測定5次，分別用紫外可見分光光度測定吸光值。吸光度分別為0.4064、0.4297、0.4285、0.4028和0.4282，相對標準誤差RSD=3.16%(n=5)，結果表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

準確稱取已測知總多糖含量的發酵天龍粉樣品5份,每份約0.5 g,各加入8.00 mg的蘆丁標準對照品,按“2.3.2”項下方法進行提取和制備溶液, 分別用紫外可見分光光度測定吸光值，并計算加樣回收率。結果平均回收率為98.95% ，相對標準誤差RSD=2.33%。結果表明該方法符合回收率在95%～105%的要求。

2.3.7 樣品測定

精密量取已經制備好的測總多糖的樣品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容后，量取2mL置于具塞試管中，按照“2.3.2”項下方法在490 nm 處測定吸光度，通過回歸方程計算總多糖的濃度，然后總多糖的含量，結果見表1。

3 討論

(1)多糖為天然產物，來源廣泛，具有毒副作用小、無殘留、不產生耐藥性等優點，因而備受研究者重視[4]。多糖廣泛存在于自然界中，是多種中藥的有效成分之一，而且具有很多生物活性, 多糖類藥物的研制已成為當今世界新藥的發展方向之一[6]。發酵天龍粉中多糖的含量明顯高于未發酵天龍中多糖的含量[7]，具有較高的開發利用價值。本實驗采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，實驗過程中，影響紫外吸收的因素有很多，待測物質有混懸顆粒、待測溶液中有干擾的吸收物質等，需要排除影響因素。采用分光光度法測定多糖的含量精密度、穩定性以及重現性都符合實驗要求，可以用來測定發酵天龍粉中總多糖的含量。

表1 發酵天龍粉中總多糖的含量

(2)將中藥天龍粉作為固體培養基，球孢白僵菌作為發酵藥用真菌，采用固體發酵炮制方法所產生的發酵天龍粉，是傳統中藥炮制技術與現代生物技術的完美結合。對蟲類中的原有物質進行結構修飾和改造，增強其攻毒散結的作用。但是蟲類中藥的發酵炮制制藥目前的研究報道并不多見，應該引起人們的足夠重視[8]。天龍的治療疾病作用顯著，其中所含有的多糖成分又是其中發揮作用的重要組成部分，因此對總多糖對其提取以及含量的測定具有積極的作用，對于臨床用藥具有一定的促進作用。

[1] 朱良春. 蟲類藥的臨床應用——守宮[J]. 江蘇醫藥, 1977(8) ：20-22.

[2] 劉玉軍,李 剛,馬 睿,等.天龍抗腫瘤研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(7):262-264.

[3] 徐曉飛,陳 健.多糖含量測定的研究進展[J].食品科學, 2009, 30(21):443-448.

[4] 郭浩杰, 楊嚴格,安 樂,等. 中藥多糖的分子修飾及其藥理活性研究進展[J]. 中草藥, 2015, 46(7):1074-1080.

[5] 李計萍. 中藥新藥研究中多糖含量測定方法探討[J].中國中藥雜志,2014(17):3392-3394.

[6] 田庚元,馮宇澄,林穎. 植物多糖的研究進展[J].中國中藥雜志, 1995 , 20 (7) :441-444.

[7] 王 穎,馬明珠,王立娜,等. 發酵前后天龍粉水溶性活性物質含量對比研究[J]. 湖南中醫雜志,2016(09):166-168.

[8] 王 穎,王立娜,劉春雨,等. 發酵天龍粉中總黃酮含量測定方法研究[J]. 山東化工,2017,46(02):64-65,67.

(本文文獻格式：張由芹，王穎，朱明珠，等.發酵天龍粉中總多糖的含量測定方法研究[J].山東化工，2017，46(16)：87，94.)

Study on the Determination Method of Total Polysaccharides Content in the Fermented Gekko Powders

Zhang Youqin1, Wang Ying1,Zhu Mingzhu1, Wang Jihui2

(1. The pharmacy college , Shandong University of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China;2.The experiment center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine ,Jinan 250355,China)

Objective: To establish the method for determining the contents of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders. Methods: Total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders were extracted by ultrasonic water extraction. UV-VIS spectrophotometry was adopted to determine the content of total polysaccharides.Results:The polysaccharides contents of the fermented Gekko powders was 13.4628mg/g,RSD was 4.19%(n=5).Conclusion: The determination of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders use the UV-VIS spectrophotometry , the method is simple and accurate. So the method can be used to determine the content of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders.

fermentation of Gekko powders; total polysaccharides; content determination;ultrasonic water extraction;UV-VIS spectrophotometry

R284

：A

：1008-021X(2017)16-0087-01

2017-06-01

山東中醫大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(項目編號：2016055)

張由芹(1995—)，女，山東沂水人，本科在讀，研究方向：制藥工程;通訊作者：王集會(1962—)，副教授，研究方向：蟲類中藥發酵及活性成分研究。