金花葵和葵花葉提取物的亞硝酸鹽清除能力的初步研究

樸明淑+李美蘭+葛冰潔+李一婷+姜成哲

【摘 要】為了研究金花葵和葵花葉提取物對亞硝酸鹽的清除作用，本實驗首先利用苯酚-硫酸法對金花葵提取物和葵花葉提取物的多糖含量進行測定，在波長為490nm處測定吸光度，實驗表明，標準葡萄糖溶液在4-32μg/mL之間與NaNO2 的清除率呈現良好的線性關系。此方法簡便，可操作性強，準確性高。在弱酸性條件下，亞硝酸根能使對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸CL-奈胺反應生成紅色偶聯化合物。利用此原理，可通過測定反應溶液的吸光度，比較兩種提取物及抗壞血酸對亞硝酸鹽的清除作用，實驗結果顯示：金花葵提取物和葵花葉提取物對NaNO2 都有一定的清除作用，清除作用：抗壞血酸>金花葵提取物>葵花葉提取物。

【Abstract】In order to study the nitrite scavenging capacity of the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， this test firstly uses phenol-sulfuric acid method measure the content of polysaccharide in the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， and measure the absorbancy at a wavelength of 490 nm， the test shows that， the standard glucose solution showed a good linear relationship with the clearance rate of NaNO2 between the 4 uglml to 32 ug/mL. This method is simple， easy to operate and high accuracy. In the weak acid condition， the nitrite can make the amino benzene sulfonic acid re-nitriding， and then react with the hydrochloric acid alpha amine to form the red coupling compound. According to this principle， through measurement of absorbance in reaction solution， we can compare the scavenging effects of these two exacts and ascorbic acid on nitrite. The experimental results show that the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves had scavenging effect on NaNO2， the scavenging effect of ascorbic acid is bigger than extracts of abelmoschus manihot and bigger than extracts of sunflower leaves.

【關鍵詞】金花葵；葵花葉；多糖含量；NaNO2清除率

【Keywords】abelmoschus manihot； sunflower leaves； polysaccharide content； NaNO2 clearance rate

【中圖分類號】TQ460.1 【文獻標志碼】A 【文章編號】1673-1069（2017）09-0191-02

1 引言

金花葵（Aurea helianthu），又名菜芙蓉，也稱野芙蓉。金花葵具有良好的清熱解毒、鎮痛消炎、降血脂、免疫調節、抑制腫瘤細胞、抗氧化、抗衰老等作用，具備很強的藥用價值。

2 實驗目的

本實驗使用的葵花葉提取物是來自于向日葵的葵花葉提取物，向日葵是菊科向日葵屬的一年生草本植物，向日葵的葉分為真葉和子葉。莖下部分葉片在開花前制造養分，主要供給根部生長，到開花時其功能基本結束。中上部葉片制造的養分主要供給花盤促使種子形成，葵花葉中含有多糖及多種微量元素，營養豐富，利用價值很高。[1]

維生素C，英文名Vitamin C，又稱L-抗壞血酸，是多數生物的必需營養素。抗壞血酸在多數生物體內可以借助新陳代謝制造而來，人類例外。在生物體內，抗壞血酸是一種抗氧化劑，其作用是保護機體免于自由基的傷害。維生素C有兩種異構體，分別為L-型和D-型，只有L-型的異構體才具備一定的生理功能，還原型和氧化型都有生理活性[2]。維生素C的主要功能有：① 還原作用，維持巰基酶的活性、促進鐵的吸收、促進四氫葉酸形成、促進抗體形成；②參與羥化反應，促進有機物或毒物羥化解毒、促進類固醇羥化、促進神經遞質（5-羥色胺及去甲腎上腺素）合成；③其他功能：解毒、預防癌癥、清除自由基。[3]

3 實驗過程

金花葵提取物和葵花葉提取物含有豐富的多糖成分，由目前研究證明，多糖對NaNO2具有一定的清除作用，亞硝酸鈉是一種食品添加劑，主要用于腌制肉食類食品，其可以保持食品鮮艷的色澤，抑制肉毒芽孢桿菌。但是，當亞硝酸鹽進入人體后，會與磷脂、氨基酸等有機物質發生胺類反應，該反應可生成具有強烈致癌作用的亞硝胺。因此，亞硝酸鈉可以說是一種潛在的致癌物質，那么對它的清除作用的研究也顯得尤為重要[4-5]。苯酚-硫酸法[6-7]是常用的測定多糖含量的方法，本實驗也是利用此方法來測定兩種提取物中的多糖含量。此外，本實驗也測定了金花葵提取物、葵花葉提取物中的多糖對NaNO2的清除作用，其測定原理是：多糖可將NaNO2氧化消耗，而未參與反應的亞硝酸根在弱酸性環境下，可使對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸α-奈胺偶合生成紅色偶聯化合物，通過測定該溶液吸光度，即可計算出多糖對NaNO2的清除率。endprint

①實驗材料。金花葵花，來自延吉郊區；葵花葉，采自龍井郊區。

②實驗儀器。紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）。

③實驗試劑。NaNO2；檸檬酸鈉緩沖液；0.4%對氨基苯磺酸；0.2%鹽酸α-奈胺。

④實驗方法。

金花葵提取液：配制成濃度為1mg/ml溶液備用。

葵花葉提取液：配制成20mg/ml的溶液，搖勻，靜置。使用時，吸取上清液1ml，加入9ml蒸餾水稀釋為2mg/ml的溶液。

抗壞血酸溶液：配制成500μg/ml抗壞血酸溶液備用，用時稀釋成100μg/ml。

葡萄糖標準液配制成濃度為0.04mg/ml的葡萄糖標準溶液。

0.1%NaNO2溶液（用時稀釋100倍）。

0.5mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=3）： 配制成0.5mol/L檸檬酸鈉溶液；配制成0.5mol/L檸檬酸溶液；按1.4mL：18.6mL的比例混合，搖勻，得到0.5mol/L檸檬酸鈉緩沖液（PH=3）。

⑤標準曲線的制備。分別吸0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml， 1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml的0.04mg/ml的葡萄糖標準液，置于5ml的試管中，加水補足到2ml，加入0.2ml 6%苯酚，震蕩混勻后，快速滴加濃硫酸1ml，靜置5min后，置于沸水浴中加熱15～20min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長490nm處測吸光度。

⑥樣品中多糖含量的測定。按照上述標準曲線制作過程，分別對金花葵提取物及葵花葉提取物中的多糖含量進行測定，通過測定樣品液的吸光度，根據標準曲線計算出樣品中多糖含量。

⑦NaNO2清除率的測定。提取物及抗壞血酸對NaNO2的清除率的測定：取6支試管，按下表加入試劑。加入試劑后，搖勻，置于37°C恒溫水浴中加熱1h后取出。從6支試管中分別吸取0.75ml溶液，置于潔凈試管中，并加入1.5ml 0.4%對氨基苯磺酸、0.75ml 0.2%鹽酸α-奈胺，搖勻，暗處放置15min后，在波長540nm處測定吸光度值。 NaNO2的清除率的計算公式： 清除率（%）=（A對照-A樣品）/A對照x100%

4 實驗結果

4.1 樣品多糖含量的測定

按上述多糖含量測定方法，分別對金花葵提取物和葵花葉提取物同時測定三次吸光度，金花葵提取物吸光值分別為0.126，0.123，0.125，葵花葉提取物的吸光值分別為0.117，0.118，0.114。根據計算得，金花葵提取物中多糖的平均含量為14.2%，葵花葉提取物中多糖的平均含量為13.3%。

4.2 標準曲線回歸方程的建立

用紫外分光光度計在波長為490nm處測定1.2.3中各反應后溶液吸光度，試管1為對照組，得到線性回歸方程為：Y=1.575X+0.0115，R2=0.9881，說明葡萄糖在0.004mg/ml-0.032mg/ml范圍內很好地符合朗白-比爾定律。

4.3 金花葵提取物溶液對NaNO2的清除作用

第一，根據吸光度計算樣品溶液對NaNO2的清除作用，在0.2～1.0mg/ml范圍內，金花葵提取物對NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關系，計算出其50%抑制濃度IC50=0.71mg/ml。第二， 葵花葉提取物溶液對NaNO2的清除作用。根據吸光度計算樣品溶液對對NaNO2的清除作用，在0.4～2.0mg/ml范圍內，葵花葉提取物對NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關系，計算出其50%抑制濃度IC50=1.5mg/ml。第三， 抗壞血酸對NaNO2的清除作用。根據吸光度計算樣品溶液對NaNO2的清除作用，在10～100μg/ml范圍內，抗壞血酸對NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關系，計算出其50%抑制濃度IC50=0.053mg/ml。

5 結論

通過實驗測出金花葵提取物中多糖含量占14.2%，葵花葉提取物中的占13.3%。此外，金花葵提取物、葵花葉提取物和抗壞血酸都對NaNO2具有一定的清除作用，三者IC50分別為0.71mg/ml、1.5mg/ml、0.053mg/ml，即對NaNO2的清除作用：抗壞血酸>金花葵提取物>葵花葉提取物。

【參考文獻】

【1】索金玲.向日葵花盤中有效化學成分分析及抗氧化性測定[D]. 烏魯木齊：新疆大學，2013.

【2】汪東風.食品化學[J].北京：化學工業出版社，2009（10）：123-125.

【3】葛可佑.公共營養師 基礎知識[M].北京：中國勞動社會保障出版社，2013.

【4】丁曉雯，劉春紅.食品安全學[M].北京：中國農業出版社，2011.

【5】劉寧，沈明浩.食品毒理學[M].北京：中國輕工業出版社，2007.

【6】余曉雷，張可，鄭旭霞.蘆薈中多糖含量測定方法的探討[J].營養學報，2003（7）：149-152.

【7】聶國朝.中藥木瓜多糖的提取分離及含量測定[J].微量元素與健康研究，2003（5）：30-38.endprint