從雌激素受體探討解毒祛瘀滋陰藥對SLE的治療機制*

王大維 汪梅姣 谷煥鵬 溫成平

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

·研究報告·

從雌激素受體探討解毒祛瘀滋陰藥對SLE的治療機制*

王大維 汪梅姣 谷煥鵬 溫成平△

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

目的 觀察解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對雌激素受體α和β及其相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用，從而探討解毒祛瘀滋陰藥治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的機制。方法 CCK-8法檢測研究解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對MCF-7細胞增殖的影響；以FITC-Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測10%解毒祛瘀滋陰藥含藥血清誘導(dǎo)MCF-7細胞的凋亡率；Realtime-PCR法檢測ERα和PI3KmRNA的表達；Western blot法檢測雌激素受體相關(guān)信號通路蛋白ERα、p-ERα、ERβ、ERK、p-ERK的表達。結(jié)果 10%和15%的解毒祛瘀滋陰藥含藥血清與空白血清相比均能較輕的抑制MCF-7細胞的增殖 （P＜0.01）。與空白血清相比，10%的解毒祛瘀滋陰藥含藥血清：使MCF-7細胞的早期凋亡較多；使ERα和PI3K的mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；使ERα的蛋白表達和磷酸化水平降低；使ERβ的蛋白表達水平升高；使ERK的蛋白表達和磷酸化水平降低。結(jié)論下調(diào)ERα的表達和其磷酸化水平，促進ERβ的表達，下調(diào)ERK及其磷酸化進而影響MAPK/ERK信號通路也許是解毒祛瘀滋陰藥治療SLE的部分機制。

解毒祛瘀滋陰藥 雌激素受體 信號通路 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種典型的自身免疫性結(jié)締組織病，可累及全身各個系統(tǒng)。SLE病情易遷延反復(fù)，嚴重危害著患者的生活質(zhì)量，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，尤其好發(fā)于育齡期女性，患者男女比例約為1∶7～9［1］。SLE 病因復(fù)雜，除了遺傳因素、環(huán)境因素之外，雌激素被認為是影響SLE發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［2-3］。妊娠期患者病情明顯加重，而絕經(jīng)后的患者病情有不同程度的緩解［4］。眾多臨床研究證明雌激素從不同環(huán)節(jié)影響著SLE。本課題組長期以來的臨床研究發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀滋陰藥對SLE的療效明顯，并且發(fā)現(xiàn)其對雌激素有調(diào)節(jié)作用［5］。因此本文從雌激素受體的調(diào)節(jié)來探討其治療SLE的機制。由于外周血中提取的T、B細胞培養(yǎng)過程中死亡速度較快，導(dǎo)致檢測指標不穩(wěn)定，難以明確數(shù)據(jù)波動原因，MCF-7細胞既表達雌激素受體α（ERα），又表達雌激素受體 β（ERβ），是研究雌激素受體（ER）相關(guān)通路的良好模型。于是本課題組選取表達雌激素受體的人乳腺癌MCF-7細胞作為載體，并加雌激素模擬體內(nèi)環(huán)境，以含解毒祛瘀滋陰藥的大鼠血清為主要干預(yù)因素進行研究。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和動物 人乳腺癌MCF-7細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。培養(yǎng)條件：含胎牛血清（FBS）10%的DMEM高糖培養(yǎng)基（青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L），飽和濕度、37 ℃、5%CO2。 培養(yǎng)基一般隔天更換。當(dāng)細胞匯合約90%時傳代。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。Wistar大鼠，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試藥與儀器 解毒祛瘀滋陰方生藥購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%Trypsin均購自于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，美國 GEMINI公司；17β-雌二醇（E2），Sigma-Aldrich；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；Realtime-PCR試劑盒，美國BIO-RAD公司；ERα抗體、p-ERα抗體（phospho S106）、ERβ 抗體 （ab92306）、Akt抗體、ERK 抗體、p-ERK1（pT202/pY204）/ERK2（pT185/pY187）抗體，均購自于英國Abcam公司；引物設(shè)計與合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。熒光倒置顯微鏡，Olympus；CO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Scientific Varioskan flash多功能酶標儀，Thermo；Realtime-PCR 儀，BIO-RAD； 槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，BIO-RAD；雙通道紅外掃膜儀（Odyssey），Licon。1.3 含藥血清的制備 解毒祛瘀滋陰方1劑以單蒸水800 mL煎煮1 h，共煎2次，將2次的中藥水煎劑混合后，再以R202型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將中藥水煎劑濃縮成4 g/mL。取20只Wistar大鼠，隨機分為空白組和中藥組，每組10只。中藥組按人等效劑量的16倍生藥劑量灌胃解毒祛瘀滋陰方水煎劑；空白組以同等體積的生理鹽水灌胃。每日1次，前6 d灌胃期間正常飼養(yǎng)。第7日灌胃前禁食12 h（自由飲水），灌胃1 h后心臟采血。血液室溫靜置45 min，3000 r/min離心30 min。吸取上清，同組上清合并，并于56℃水浴30 min滅活。于超凈工作臺內(nèi)以0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，分裝，得到空白血清和含藥血清，-80℃保存。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞，以5000/孔接種于96孔板，每孔液體總量為100 μL。接種12 h后分組用藥。1）空白組：100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS），不含細胞和藥物。2）空白對照組：正常培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞；3）空白血清組：正常培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞加10%（體積比）的空白血清；4）10%含藥血清組：正常培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞加10%的含藥血清。5）15%含藥血清組：正常培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞加15%的含藥血清。各組均加E2：300 pg/mL，并設(shè)3個復(fù)孔。用藥干預(yù)24 h后，每孔加10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。搖床低速搖10 min，用酶標儀以450 nm檢測各孔吸光度值（A450）。實驗重復(fù)3次。細胞存活率的計算：細胞存活率（%）=（實驗組 A450 均值-空白組 A450 均值）/（空白對照組A450均值-空白組A450均值）×100%

1.5 流式細胞術(shù)檢測MCF-7細胞的凋亡 取對數(shù)生長期細胞，以1×105/mL種于六孔板，培養(yǎng)12 h后按實驗分組用藥，分別為空白對照組，含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基；空白血清組，含10%空白血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；含藥血清組，10%含藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；各組均加E2：300 pg/mL。藥物作用24 h后以不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，收集細胞。預(yù)冷的PBS漂洗細胞，離心棄上清，以 1×Binding Buffer 100 μL 重懸細胞。每管加入 5 μL FITC Annexin V，室溫避光孵育10～15 min。上機前5 min每管加入 5 μL PI，而后 1×Binding Buffer 400 μL 混勻，上機檢測。正常培養(yǎng)的MCF-7細胞分為3組：陰性對照組，即不加熒光染料的細胞；Annexin V-FITC組；Annexin V-PI組。

1.6 Realtime-PCR法檢測ERα和PI3K的表達 取對數(shù)生長期細胞，以1×105/mL種于六孔板，培養(yǎng)12 h后分為3組，分組同前（同流式細胞術(shù)檢測）。每組均加E2：300 pg/mL。每組3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后以Trizol提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，選30 μL體系，加1.5 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃冷卻；-20℃保存。PCR 引物如下，GAPDH，F(xiàn)：CTGCCAACGTGTCAGT。 R：GTTG AGGGCAATGCCA；ERα。F：AGATAATCGACGCCAGG GTG。 R：AGCATAGTCATTGCACACTGCAC。 PI3K，F(xiàn)：ATGGGGATGATTTACGGC。 R：TCTCCTTTGTTCTTGT CTTTGA。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，15 s； 擴增40個循環(huán)；72℃，10 min。溶解曲線條件：以60℃為初始溫度，每隔30 s升高0.5℃，直到溫度升至95℃。空白血清組和含藥血清組的目的基因相對于正常組的表達量通過 2-△△Ct計算得出。△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）血清組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）空白對照組。

1.7 Western blot法檢測雌激素受體相關(guān)蛋白的表達上述各組細胞以相應(yīng)藥物作用48 h后，以0.25%Trypsin消化，1000 r/min離心5 min收集細胞，以4℃預(yù)冷的PBS漂洗。而后每孔細胞（六孔板）用預(yù)冷的RIPA 200 μL （含 1%PMSF） 在冰上裂解 30 min，12000 r/min，4 ℃離心 15 min， 小心吸取上清 100 μL。Bradford法測各樣本的蛋白濃度，以生理鹽水調(diào)整使?jié)舛纫恢隆⒏鹘M樣本以5×Loading buffer混勻，金屬浴加熱100℃10 min充分變性。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳條件：60 V，約30 min；濕轉(zhuǎn)法80 V，2 h，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗。 一抗孵育：4℃，12 h；漂洗后，熒光二抗室溫避光孵育2 h；漂洗后以雙通道紅外掃膜儀掃描。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0和Excel2007統(tǒng)計軟件。多組間比較采用單因素方差分析 （one-way anova）。 計量資料以（±s）表示，顯著性檢驗水準為0.05（雙側(cè)）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 見表1。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白血清相比10%的含藥血清和15%的含藥血清均使人乳腺癌MCF-7細胞的增殖活性降低（P<0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中15%的含藥血清雖然比10%的低，但二者相比差異無顯著性（P＞0.05），本實驗?zāi)康氖茄芯看萍に厥荏w相關(guān)通路而不是增殖抑制，故后續(xù)實驗中以10%的含藥血清進行干預(yù)。

表1 解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響（s）

表1 解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響（s）

與對照組和空白血清組比較，**P＜0.01。下同。

組 別 n OD值 存活率（%）空白對照組 3 0.436±0.001 100.00±0.23空白血清組 3 0.404±0.002 92.75±0.75 10%含藥血清組 3 0.368±0.004** 84.58±1.17**15%含藥血清組 3 0.358±0.006** 82.11±1.62**

2.2 解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對MCF-7細胞凋亡的影響 見圖1，表2。以FITC-Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對MCF-7細胞凋亡的影響，見圖1。空白血清和含藥血清都能誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，含藥血清組的總凋亡率最高。對FITC/PI雙熒光參數(shù)散點圖分析早期凋亡和晚期凋亡的分布結(jié)果見表2。與空白對照組和空白血清組相比，含藥血清主要引起早期凋亡。

圖1 FITC-Annexin V/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測凋亡率

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡比例s）

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡比例s）

組 別 n 正常活細胞 早期凋亡細胞 晚期凋亡細胞 總凋亡率（%）壞死細胞空白對照組 3空白血清組 3 83.57±1.90 7.37±0.95 5.50±0.53 74.60±0.75 12.47±0.66 7.10±0.70 12.87±1.40 3.43±0.76 19.57±1.25 5.83±0.71含藥血清組 371.00±1.08 20.63±1.98** 5.17±0.5025.80±1.49**3.23±0.74

2.3 Realtime-PCR法檢測解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對ERα和PI3K表達的影響 見表3。以目的基因和GAPDH 的 Ct差值，采用雙 DELT 法（2-△△Ct）計算實驗組目的基因相對于空白對照組的表達量。與空白對照組相比，ERα的mRNA表達量在空白血清組和含藥血清組均顯著降低（P<0.01）；PI3K的mRNA表達量，空白血清組升高（P＞0.05），含藥血清組表達明顯降低（P<0.01）。含藥血清組與空白血清組相比，ERα和PI3K的mRNA表達量均降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 或 P<0.01）。

表3 各組ERα和PI3KmRNA相對表達量比較s）

表3 各組ERα和PI3KmRNA相對表達量比較s）

與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n ERα PI3K空白對照組 3 1 1空白血清組 3 0.48±0.05△△ 1.32±0.17含藥血清組 3 0.31±0.06△ 0.27±0.02△△

2.4 解毒祛瘀滋陰藥含藥血清對雌激素受體相關(guān)蛋白表達的影響 見圖2，圖3。對ERα、p-ERα、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）、以及絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的影響，見圖2。由圖可知與空白對照組和空白血清組相比，10%的解毒祛瘀滋陰藥含藥血清干預(yù)MCF-7細胞24 h后，可以使ERα的蛋白表達和其磷酸化水平降低，使ERK的蛋白表達和其磷酸化水平明顯降低，而對AKT的蛋白表達幾乎沒有影響。與空白血清組相比，含藥血清可以使ERβ表達升高，見圖3。

圖 2 ERα、p-ERα、ERK、p-ERK、AKt蛋白的表達

圖3 ERβ的蛋白表達

3 討 論

有Meta分析認為雌激素與SLE的進展有明顯的因果關(guān)系［6］。目前認為雌激素受體主要分為兩種亞型：α型和β型，在生殖、呼吸、心血管以及骨骼等不同的組織或細胞中表達程度不同，生物學(xué)效應(yīng)也不同［7］。它們不僅僅存在于細胞核也存在于細胞膜、細胞質(zhì)以及線粒體。雌激素與受體結(jié)合后，通過與靶基因雌激素反應(yīng)元件（ERE）的結(jié)合，激活或者抑制靶基因的調(diào)控區(qū)，實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)節(jié)，此途徑稱為雌激素受體作用機制的經(jīng)典基因組途徑，除此之外還有非經(jīng)典的基因組途徑和非基因組途徑［8-9］。ERα和ERβ均形成同型或者異型二聚體而發(fā)揮作用。已有的研究表明，ERβ對ERα有抑制作用，而且會降低細胞對雌激素的敏感性［10］。 ERβ 的激活也會起到一定的抗炎作用［11］。ERα的活性升高會降低ERβ的穩(wěn)定性［12］。在SLE的模型動物敲除ERα后蛋白尿和ds-DNA抗體明顯降低［13］。似乎ERα/ERβ的比值升高不利于 SLE。但是當(dāng)ERα不表達時，ERβ可替代ERα的部分作用，說明二者之間呈現(xiàn)的是此消彼長的關(guān)系，在某些情況下相互拮抗，有時又互相補充。

ER的快速效應(yīng)被認為是通過細胞膜上雌激素受體（mER）的非基因組途徑來實現(xiàn)的，E2與mER結(jié)合后可以活化MAPK信號通路以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信號通路。后來Thomas研究表明ERβ1可以通過促進c-Cb-1對EGFR的降解而使ERK1/2失活［14］。ERK 屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，其中ERK1和ERK2目前研究的比較透徹。我們的研究結(jié)果表明解毒祛瘀滋陰藥的含藥血清可以使ERβ表達升高，而ERK和p-ERK的表達均降低。由Thomas的研究結(jié)果推斷，滋陰藥的含藥血清使ERK和p-ERK的表達降低是也許由于促進了ERβ的表達而導(dǎo)致的。

MAPK信號通路在細胞的生長、分化、遷移、死亡等方面都起著重要的調(diào)節(jié)作用。MAPK的級聯(lián)反應(yīng)又可以使nER磷酸化，磷酸化的nER激活Pak1、PkA和AKT等［15］。所以雌激素受體的基因組途徑和非基因組途徑以及MAPK/ERK通路和PI3K/AKT通路之間存在著復(fù)雜的相互聯(lián)系。

PI3K活化后產(chǎn)生第二信使PIP3，后者結(jié)合并活化AKT并可以使AKT轉(zhuǎn)移到細胞膜上。活化的AKT磷酸化ERα的AF-1區(qū)中的絲氨酸殘基，從而調(diào)節(jié)ERα。Sandra等研究發(fā)現(xiàn)PI3K的抑制劑LY294002可以使AKT、p-AKT下調(diào)，而且ERα總蛋白和p-ERα也下調(diào)［16］。這表明ERα和PI3K/AKT信號通路之間可以形成相互調(diào)節(jié)相互影響的環(huán)路。我們的實驗結(jié)果顯示，解毒祛瘀滋陰藥含藥血清使PI3K的mRNA和ERα蛋白以及p-ERα表達下調(diào)，這有可能對ERα-PI3K/AKT這一環(huán)路產(chǎn)生了影響。

綜上所述，下調(diào)ERα的表達和其磷酸化水平，促進ERβ的表達，下調(diào)ERK及其磷酸化進而調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路以及ERα-PI3K/AK環(huán)路，這也許是解毒祛瘀滋陰藥治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的部分機制。但是ERβ的調(diào)控機制目前仍然沒有定論，對ERβ的認識仍然比較狹窄，還有待于深入研究。

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Exploration on the Mechanism of Jiedu Quyu Ziyin Decoction on SLE from Estrogen Receptor

WANG

Dawei，WANG Meijiao，GU Huanpeng，et al. Basic Medical College of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective： To study the regulation of of Jiedu Quyu Ziyin Decoction （JQZR） on estrogen receptor α and β and their related pathways in the serum，and to explore the mechanism of JQZR on SLE.Methods： CCK-8 method was used to detect the proliferation of MCF-7 cells.The FITC-Annexin V/PI double staining method was used to detect the apoptosis rate of MCF-7 cells induced by medicated serum containing 10%JQZR.The expression of mRNA of ERα and PI3K was detected by Realtime-PCR.The expression of ERα，p-ERα，ERβ，ERK and p-ERK were detected by Western blot.Results：The proliferation of MCF-7 cells was significantly inhibited by 10%and 15%of JQZR Compared with the blank serum（P<0.01）.Compared with the blank serum，medicated serum of 10%JQZR made MCF-7 cells more early apoptosis and mRNA expression of ERα and PI3K was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）.The protein expression and phosphorylation levels of ERα decreased.Protein expression levels of ERβ increased and protein expression and phosphorylation levels of ERK decreased.Conclusion： Down-regulation of ERα expression and phosphorylation level，promotion of ERβ expression，downregulation of ERK and its phosphorylation and regulation of the signaling pathway of MAPK/ERK may be part of the mechanism of JQZR on SLE.

Jiedu Quyu Ziyin Decoction（JQZR）；Estrogen receptor；Signaling pathway；Systemic lupus erythematosus（SLE）

R593.24+1

A

1004-745X（2017）09-1505-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.001

2017-05-26）

國家自然科學(xué)基金項目（81373633）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（2012ZY01）

△通信作者（電子郵箱：wengcp@163.com）