何首烏抗性淀粉促進(jìn)靶向結(jié)腸微丸體外藥物釋放研究

李聞濤 ，萬(wàn) 科 ，楊 瑩 ，阮婧華 ，3 ，曹佩雪 ，楊小生

（1.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 西安 712046； 2.貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550016； 3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

研究

何首烏抗性淀粉促進(jìn)靶向結(jié)腸微丸體外藥物釋放研究

李聞濤1，萬(wàn) 科2，楊 瑩2，阮婧華2，3，曹佩雪2，楊小生2

（1.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 西安 712046； 2.貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550016； 3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的探討何首烏抗性淀粉（RS)作為靶向結(jié)腸微丸材料的可行性。方法 考察生理?xiàng)l件下RS與微晶纖維素(MCC)不同比例微丸溶出速率的變化；以苦參堿（MT）為模型藥物，擠出滾圓法制備微丸，觀察相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 RS對(duì)微丸的釋放有顯著的影響。藥物體外釋放研究表明，當(dāng)RS／MCC小于0.5時(shí)微丸得率、球形和脆碎度分別 ＞80.00%，＞0.95，＜0.12%。RS高含量的微丸對(duì)pH變化和酶解的耐受性顯著提高。在微生物大腸桿菌作用下，微丸迅速崩解，在30 min內(nèi)藥物溶出超過(guò)82%。結(jié)論 何首烏抗性淀粉是一種有前途的口服傳遞系統(tǒng)，可在結(jié)腸靶位發(fā)揮藥效。

抗性淀粉；結(jié)腸靶向；成型性；藥物釋放腸靶向；成型性；藥物釋

R282.71；R285.5

A

1006－4931(2017)17－0006－04

結(jié)腸微生物數(shù)量和種類巨大（與胃腸道其他部位相比），且個(gè)體間pH和轉(zhuǎn)移時(shí)間差別小，故結(jié)腸作為藥物靶向部位具有較好可靠性[1]。選擇pH敏感或?qū)Y(jié)腸微生物敏感的聚合物作為固體制劑的載體或包衣材料，可有效地靶向藥物至所需釋放部位[1-2]。淀粉是一種安全、無(wú)毒的藥用輔料，但天然淀粉不完全適合一些特定用途，需要進(jìn)行物理、化學(xué)和酶性修飾。因此，淀粉衍生物已被用于片劑、微粒和包衣膜控制藥物釋放速率[3]。抗性淀粉（RS）又稱抗酶解淀粉，對(duì)pH變化不敏感，可抵抗胃內(nèi)及十二指腸消化，在胃腸道上半部位降解速率慢；在胃腸道下半部，受腸道微生物的影響大，尤其可被結(jié)腸微生物降解吸收，因而可用于靶向結(jié)腸藥物傳遞系統(tǒng)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，何首烏淀粉以直鏈為主，相對(duì)分子質(zhì)量大，極易制備得到高含量RS。本研究中以抗菌消炎中藥苦參堿為模型藥，考察RS與微晶纖維素（MCC）不同比例對(duì)微丸成型及藥物釋放的影響，探討何首烏RS作為靶向結(jié)腸微丸輔料的可行性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：WFH-203型紫外分析儀，1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；E50型軸向單螺桿擠出機(jī)，S-250型滾圓機(jī)，WBF-1G型多功能流化床，均購(gòu)于重慶英格制藥機(jī)械有限公司；78X6A型片劑四用測(cè)定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；WD-A型藥物穩(wěn)定性檢查儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）；HGC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；Centrifuge 5418型小型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；KQ300DA型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲清洗器有限公司）。

試藥：RS（含量為 56.2% ，自制）；苦參堿（MT，純度為98.0%，寶雞市永嘉天然植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)為201501）；MCC（江西益普生藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20161201）；羥丙基甲基纖維素（HPMC，湖州展望藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20160516）。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 濕材制備

將MT和輔料RS，MCC按表1處方比例混勻，過(guò)80目篩，再加入適量3%濃度的HPMC水溶液制得軟材，混合，膏體放入真空保干器靜置1 h，使水分達(dá)平衡。均在室溫[（21 ±3）℃ 、相對(duì)濕度（40±5）%]下進(jìn)行操作。

表1 擠出滾圓微丸設(shè)計(jì)處方

1.2.2 丸芯制備

擠出-滾圓的主要工藝因素為擠出速度、滾圓轉(zhuǎn)速和滾圓時(shí)間。擠出速度和滾圓時(shí)間主要影響成球性能。擠出速度低，軟材暴露時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致物料失水，使部分微丸呈棒狀；速度過(guò)高，直接影響微丸收率。滾圓時(shí)間過(guò)短，微丸的外觀不圓整，且收率較低，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)微丸圓整度會(huì)變差。滾圓轉(zhuǎn)速對(duì)微丸成型影響較大，轉(zhuǎn)速過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致向心力和摩擦力變小，造成微丸的外觀呈棒狀；轉(zhuǎn)速過(guò)大，微丸彼此摩擦力增大，容易裂碎，導(dǎo)致收率降低。通過(guò)前期試驗(yàn)最終確定了制備工藝，即擠出速度 40 r／min，滾圓轉(zhuǎn)速 1 000 r／min，滾圓時(shí)間 15 min，濕丸 40 ℃烘干 24 h，整粒（0.6～0.9 mm），即得。均在室溫下[溫度（21 ±3）℃，相對(duì)濕度（40 ±5）%]操作。

1.2.3 體外溶出度測(cè)定

測(cè)定微丸溶出度按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0931 第一法轉(zhuǎn)籃法[1]。分別選擇 pH 為 1.2，6.8，7.4的緩沖溶液 900 mL、轉(zhuǎn)速 100 r／min、溫度(37 ± 0.5)℃下進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)。于不同時(shí)間點(diǎn)取樣2 mL，每次取樣后立即補(bǔ)充同溫度及體積的新鮮介質(zhì)。樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾作為供試品溶液，計(jì)算MT含量。

1.2.4 酶解耐受試驗(yàn)

胰酶是指從豬、牛、羊等動(dòng)物胰臟提取得到的多種酶混合物，在中性、弱堿性條件下以胰酶和淀粉酶作用較強(qiáng)[4]。取適量微丸加入至 20 mL 胰酶溶液（0.15 g／mL，含 1%SDS）中，37 ℃ 溫孵，不同時(shí)間點(diǎn)（20，60，120，180 min)取樣2 mL。每次取樣后立即補(bǔ)充同溫度及體積的新鮮介質(zhì)。為了停止酶活性，樣品加入80%乙醇2 mL。樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾作為供試品溶液，采用高效液相色譜（HPLC）法分析。

1.2.5 微生物降解釋放試驗(yàn)

選擇結(jié)腸大量存在的微生物大腸桿菌為考察對(duì)象[5]。大腸桿菌（E.coli ATCC 25922）在 Luria-Bertani培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃），預(yù)培養(yǎng)，使菌種成倍擴(kuò)增，達(dá)到使用要求[OD6000.8（6.0 ×108cfu ／mL)～0.7（5.5 ×108cfu ／mL）]。取40 mL培養(yǎng)物（原始 pH ＝6.5），加入100 mg微丸，持續(xù)攪拌下 37 ℃孵育。不同時(shí)間點(diǎn)（20，60，120，180 min）取樣 1 mL（終點(diǎn) pH ＝ 5.5），3 000 r／min 離心 15 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾作為供試品溶液，HPLC法分析。

1.2.6 微丸物理特性測(cè)定

得率：選取粒徑在355～850 μm間的微丸進(jìn)行檢測(cè)。取藥典用藥篩（國(guó)標(biāo)R40／3)，收集過(guò)2號(hào)篩且不能過(guò)3號(hào)篩微丸，稱質(zhì)量。按公式計(jì)算，yield＝100×（W／theoreticalweight），其中 W是實(shí)際質(zhì)量。

球形：樣品放置于玻璃片上，使用配有Motic Images Plus 2.0軟件軟件的三目顯微鏡觀察直徑、形態(tài)以及球形。球形采用公式（Riley′s sphericity index，ΨR)計(jì)算，ΨR＝ （ Di／Dc）1／2，其中 Di是目鏡下最大微丸的直徑，Dc為目鏡下最小微丸的直徑（n＝50）。

脆碎度：使用玻璃珠聯(lián)合脆碎度測(cè)定儀測(cè)定。記錄微丸初始質(zhì)量（W1）；選擇使用直徑為5 mm的250粒玻璃珠，加入樣品，25 r／min條件下持續(xù) 4 min；收集微丸，并過(guò) 3號(hào)藥篩；記錄最后質(zhì)量（W2）。脆碎系數(shù)（F）記為損失質(zhì)量的百分比，F(xiàn)(%)＝100×(W1-W2)／W1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各獨(dú)立試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，進(jìn)行Duncan′s多組間樣本差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 RS-MCC不同比例對(duì)微丸成形的影響

MCC對(duì)微丸成形有較好的促進(jìn)作用，是目前最常用的微丸藥用輔料。由圖1可知，MCC用量越大，微丸成形性越好：當(dāng)MCC輔料占比大于0.5時(shí)，圓整度、得率明顯增加。RS同時(shí)可抗環(huán)境降解和淀粉粘合。當(dāng)RS占比小于0.6時(shí)，所得到的微丸都是可接受的，得率、球形和脆碎度分別＞80%，＞0.95和＜0.12%。結(jié)果見(jiàn)表2。其中，含RS微丸脆碎度與MCC微丸相比有顯著差異，可能是由于RS淀粉粘性使得微丸物質(zhì)間粘附更緊密[6]。

圖1 RS／MCC對(duì)pH變化體外釋放度影響(n＝3)

表2 微丸物理性能評(píng)估(n＝3)

2.2 RS對(duì)pH變化時(shí)體外釋放度的影響

選擇模擬胃腸道不同部位的介質(zhì)（pH為1.2，6.8，7.4）考察藥物的釋放變化。選擇處方 F10，F(xiàn)2，F(xiàn)7，F(xiàn)11，即 RS／MCC 為 0，2∶5，1∶2，2∶3 進(jìn)行溶出度試驗(yàn)。由圖 1可見(jiàn)，F(xiàn)11在各個(gè)介質(zhì)中均顯示最低的釋放速率。4個(gè)樣品前20 min釋放基本無(wú)差異，可能是由于RS中含有少量未回生的直鏈淀粉溶解度較大，增加了短時(shí)間內(nèi)的快速釋放。60 min后溶出差異逐漸顯現(xiàn)：無(wú)RS組微丸已崩解，藥物基本釋放完全；RS高含量組（F11）溶出度與20 min釋放差異不明顯，微丸仍保持原形，推測(cè)是由于RS可抵抗pH變化造成的影響，不產(chǎn)生降解或溶解，維持了微丸的原狀[7]；吸水造成的有限程度溶脹形成了藥物釋放的阻滯層，從而有效防止微丸溶蝕，降低了釋放速度。可見(jiàn)，高含量RS的微丸對(duì)胃腸道上部生理?xiàng)l件的耐受能力較強(qiáng)。但是內(nèi)加和外加粘合劑、是否需要塑化等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。

2.3 RS對(duì)酶解耐受試驗(yàn)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，由于普通直鏈淀粉和抗性淀粉RS1，RS2的存在，前20 min藥物釋放較快；60 min后各處方出現(xiàn)明顯差異，RS含量高組方F11的釋放速率最低。推測(cè)可能是RS和HPMC的原位溶脹，促進(jìn)了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的重組，抑制了酶的進(jìn)入。制備RS的前提是取淀粉酶中不降解的直鏈淀粉，因而試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)估一致。

2.4 RS對(duì)微生物降解釋放的影響

各組方在微生物條件下的降解以及隨后藥物的釋放，采用 E.coli作為模型微生物進(jìn)行研究。E.coli是人結(jié)腸原有微生物大腸細(xì)菌，存在概率高，同時(shí)也是一種有氧菌，極易培養(yǎng)。圖2顯示了4個(gè)處方藥物的釋放情況。與模擬胃腸道pH介質(zhì)、酶解試驗(yàn)結(jié)果相比，含有RS組方微丸降解快，1 h微丸崩解，3 h藥物釋放超過(guò)90%。

圖2 RS／MCC對(duì)微生物降解釋放的影響

3 討論

對(duì)于治療各種腸道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn′s疾病、結(jié)腸癌等，靶向藥物至結(jié)腸是非常理想的。藥物傳遞系統(tǒng)應(yīng)有能力保護(hù)藥物，避免胃和小腸部位發(fā)生藥物釋放和吸收，保護(hù)藥物生理活性，確保只在結(jié)腸釋放藥物[7-9]。RS在胃和小腸內(nèi)很難被消化或吸收的特性使其成為結(jié)腸藥物傳遞系統(tǒng)的一種很有吸引力的載體。此外，RS可能是一種理想的腸道微生物藥物傳遞形式。由于可生物降解酶只存在于結(jié)腸，因此使用可生物降解的聚合物，將藥物在胃和小腸環(huán)境中被屏蔽，并將藥物輸送到結(jié)腸，受到微生物的同化，通過(guò)酶降解或分解聚合物后分子量下降，失去機(jī)械強(qiáng)度，從而釋放藥物[9]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，何首烏RS具有含量高，對(duì)胃腸道pH生理環(huán)境的抵抗能力強(qiáng)的特點(diǎn)，優(yōu)于普通玉米或小麥RS；結(jié)合多單元藥物傳遞系統(tǒng)（如微丸）的優(yōu)勢(shì)，如可重現(xiàn)的胃-腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、混合微丸的可變性、個(gè)體用藥適用的多元混合微丸以及低風(fēng)險(xiǎn)的藥物突釋[10]。因此選擇RS微丸作為靶向結(jié)腸的主要載體，并研究其對(duì)微丸成形、藥物靶向釋放的影響。通過(guò)微丸成形工藝研究，可見(jiàn)RS在微丸的擠出-滾圓過(guò)程中粘附性適中，對(duì)得率、球形和脆碎度均有較好的促進(jìn)作用。這可能與其物理性質(zhì)有關(guān)：抗性淀粉分子結(jié)構(gòu)與普通淀粉無(wú)變化，分子量和聚合度較小，可推知RS基本保留了淀粉的粘合特性，而較低的聚合度有利于微丸滾圓過(guò)程中的斷裂和成圓[11-12]；何首烏RS以RS3回生淀粉為主，具有較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)于高壓擠出產(chǎn)生的熱能具有一定的抵抗性，可有效地保護(hù)藥物。藥物在模擬生物條件下的釋放結(jié)果較好驗(yàn)證了何首烏RS的靶向結(jié)腸特性。通過(guò)結(jié)果可知，藥物在胃液（pH ＝ 1.0）、小腸液（pH ＝ 6.8）中，隨著RS含量的增加釋放量明顯下降。酶解環(huán)境中RS高含量的處方藥物釋放速率慢，推測(cè)與RS致密結(jié)構(gòu)有關(guān)：α-淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1，4糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、α-極限糊精和少量葡萄糖。由于高直鏈淀粉雙螺旋高致密結(jié)構(gòu)，尤其是RS3回生淀粉，α-淀粉酶一般難以接近糖苷鍵。這一點(diǎn)對(duì)于防止藥物在胃腸道上部過(guò)早釋放較為關(guān)鍵[2，11]。玉米、小麥RS不能被體內(nèi)微生物降解，而本研究結(jié)果表明RS可在微生物降解釋放藥物，推測(cè)這可能與RS來(lái)源于藥用植物何首烏的塊根有關(guān)，原因還有待進(jìn)一步研究[13-14]。

RS是一種新興的膳食纖維，是近年來(lái)食品、保健品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，具有類似溶解性纖維的生理功能，在小腸中不被消化，但在大腸中能部分被腸道微生物菌群發(fā)酵，產(chǎn)生多種短鏈脂肪酸，具有改善腸道環(huán)境、防止糖尿病、促進(jìn)維生素和礦物質(zhì)的吸收等功效[15]。目前，國(guó)外關(guān)于多種食品及作物中RS的制備及方法的研究已比較成熟，且有部分產(chǎn)品已上市[16]。對(duì)貴州量產(chǎn)中藥何首烏淀粉進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)所得RS含量較高，在胃腸道上部降解速率小，對(duì)多種酶也有抑制作用。體外釋放條件評(píng)估含有RS微丸靶向結(jié)腸的效果，推測(cè)RS微丸具有較好的靶向結(jié)腸釋放作用。RS的純度（RS3占比）、內(nèi)加或包衣仍需要進(jìn)一步研究。

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Study on Resistant Starch of Polygonum Multiflorum for Promoting Drug Release in Vitor of Targeted Colon Pellets

Li Wentao1,Wan Ke2,Yang Ying2,Ruan Jinghua2,3,Cao Peixue2,Yang Xiaosheng2
(1.Shaanxi Medical Equipment Quality Supervision and Inspection Institute,Xi′an,Shaanxi,China 712046; 2.Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang,Guizhou,China 550016; 3.The First Affiliated Hospital of Guiyang Chinese Medicine University,Guiyang,Guizhou,China 550002)

ObjectiveTo investigate the feasibility of resistant starch(RS)of Polygonum multiflorum as a targeted colon pellet material.Methods Under the physiological conditions,the dissolution rate of RS and microcrystalline cellulose(MCC)in different proportions of pellets was investigated,with Matrine(MT)as the model drug,the pellets were prepared by extrusion-spheronization technology,and the relevant indexes were observed.Results RS had shown significant effect on the release of pellets.In vitro drug release showed that when the RS ／MCC was less than 0.5,the yield,sphericity and crispness of the pellets were ＞ 80.00%,＞ 0.95 and ＜ 0.12%,respectively.High content of RS in pellets could significantly improve the tolerance to pH changes and enzymatic hydrolysis.Under the action of microbial Escherichia coli,the pellets rapidly disintegrated and dissolved more than 82% in 30 min.Conclusion RS of Polygonum multiflorum is a promising oral delivery system,which can exert efficacy in the colon target.

resistant starch;colonic targeting;moldability;drug release

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.002

國(guó)家自然科學(xué)基金[81360486]；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目[黔科合SY字〔2014〕3081-2號(hào)]。

李聞濤（1978-），女，碩士研究生，副高，研究方向?yàn)樗幤芳搬t(yī)療器械質(zhì)量研究，（電話）029-33585395（0）（電子信箱）931482202＠ qq.com。

阮婧華（1976-），女，博士研究生，副研究員，研究方向?yàn)樗幬镄轮苿┘鞍邢騻鬟f研究，（電話）0851-83808806(0)（電子信箱）ruanjinghua＠ aliyun.com。

2017－05－09；

2016－06－05)