高效液相色譜法同時(shí)測定山豆根中4種生物堿的含量與聚類分析

程 錢 ，鄒秦文 ，汪建芬 ，韓紅園 ，劉雯雪 ，徐柯心 ，康 帥 ，馬志強(qiáng) ，林瑞超

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102； 2.北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司，北京102600； 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

高效液相色譜法同時(shí)測定山豆根中4種生物堿的含量與聚類分析

程 錢1，鄒秦文2，汪建芬1，韓紅園1，劉雯雪1，徐柯心1，康 帥3，馬志強(qiáng)1，林瑞超1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102； 2.北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司，北京102600； 3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

目的建立同時(shí)測定山豆根中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Zorbax SB C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇（A） -0.2%磷酸（用三乙胺調(diào) pH 5.0，B）梯度洗脫，流速 1 mL ／min，檢測波長 215 nm，柱溫 30 ℃。結(jié)果 苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別在 31.40 ～2 910.47 g／mL，28.70 ～164.53 g／mL，50.16 ～813.43 g／mL，71.43～4 300.00 g／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系(r 0.999 0)，平均回收率為100.41% ～101.23%，RSD為1.82% ～2.16%（n＝6）。結(jié)論 該方法簡單、準(zhǔn)確，重復(fù)性良好。不同產(chǎn)地4種生物堿含量差異較大，道地產(chǎn)區(qū)有效成分含量相對較高。

高效液相色譜；山豆根；生物堿；含量測定；聚類分析

山豆根 Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis豆科植物越南槐 Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖[1]，又名廣豆根、大山豆根、黃結(jié)、苦豆根、南豆根等，味苦、性寒，具有瀉火解毒、消腫利咽、止痛殺蟲的功效，用于治療火毒蘊(yùn)結(jié)、咽喉和齒齦腫痛口舌生瘡等癥。山豆根中主要含有生物堿類、黃酮類、三萜類成分[2]，其中主要活性成分為生物堿類。2015年版《中國藥典（一部）》中對苦參堿和氧化苦參堿的總量規(guī)定不得低于0.7%。本研究中探討了同時(shí)測定山豆根中4種生物堿含量的方法，方法簡單、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；FW-200型藥物粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；EYELA OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；分析天平（瑞士Mettler Toledo NewClassic MF）。

1.2 材料

山豆根分別采自廣西、云南，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系王晶娟副教授鑒定為山豆根 Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis，室溫風(fēng)干，陰干后粉碎過五號篩（80目篩）備用(見表 1)。苦參堿（批號為 PS0187-0010，純度≥98.5% ），氧化苦參堿（批號為 PS0187-0020，純度≥98.5% ），槐果堿（批號為 PS160701-02，純度≥98%）、氧化槐果堿（批號為 PS160701-01，純度≥98%）均購于成都普思生物科技有限公司。甲醇為色譜純，氯仿、磷酸、三乙胺為分析純，水為哇哈哈純凈水。

表1 山豆根產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax SB C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A） -0.2%磷酸（用三乙胺調(diào) pH 至5.0，B），洗脫梯度，0→4 min時(shí) A 2%→2.6%，4→34 min時(shí) A 2.6%→2.7%，使用前用微孔濾膜過濾并進(jìn)行超聲脫氣處理；檢測波長：215 nm；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。色譜圖見圖 1，4種生物堿紫外光譜圖見圖2，通過相對保留時(shí)間和光圖譜對樣品中4種生物堿進(jìn)行歸屬。

圖1 高效液相色譜圖

圖2 紫外光譜圖

2.2 溶液制備

對照品溶液：取苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿適量，精密稱定，置5mL容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL約含苦參堿3 000.00 μg、槐果堿 660.00 μg、氧化槐果堿 1 000.00 μg、氧化苦參堿 625.00 μg 的混合溶液，即得。

供試品溶液：取山豆根粉末，精密稱量3 g，置具塞錐形瓶中，加65%乙醇60 mL，同時(shí)加入鹽酸調(diào)節(jié)pH＝0.5，超聲 30 min（功率 50 W，頻率 40 kHz），補(bǔ)足質(zhì)量，過濾，連續(xù)提取3次，合并3次濾液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇浸膏，加入40 mL蒸餾水溶解浸膏，移至250 mL分液漏斗，再向分液漏斗中加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 10.5，加40 mL氯仿，萃取，靜置20 min，取氯仿層，萃取3次，合并3次氯仿溶液，將氯仿溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得干燥物，最后用甲醇溶解，溶解物轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶內(nèi)，定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得[2]。

2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取上述對照品溶液，用甲醇稀釋成5個質(zhì)量濃度，4種生物堿的質(zhì)量濃度分別為：苦參堿31.400，486.700，854.000，1 756.000，2 910.465 μg／mL；槐果堿 28.696，70.541，100.023，120.111，164.526μg／mL；氧 化 槐 果 堿 50.163， 305.000， 406.666， 488.000，813.428μg／mL；氧化苦參堿 171.429，400.000，1200.00，2 200.000，4 300.00 μg ／mL。用 0.45 μm 微孔過濾后，分別按上述色譜條件進(jìn)樣5 μL，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y，A）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，C）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 4種成分的線性回歸方程及線性范圍（n＝5）

精密度試驗(yàn)：精密吸取1號供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿色譜峰面積的 RSD值分別為2.91%，1.87%，1.24%，1.18%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取1號供試品溶液，于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，分別測定。結(jié)果苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿峰面積結(jié)果的 RSD分別為1.77% ，1.33% ，1.18% ，2.53% （n ＝ 5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取1號供試品6份，按供試品溶液制備方法制備溶液，進(jìn)行含量測定。結(jié)果苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿的平均含量為 0.20%，0.05% ，0.27% ，1.18% ， RSD 分別為 1.77% ，2.97% ，1.6%，2.20% （n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已測定的同批次山豆根樣品6份（1號），每份約 0.25 g，精密稱取，分別加入對照品適量，依法制備供試品溶液，按照擬訂色譜條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算4種成分的平均回收率及 RSD。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

精密稱取13批山豆根各2份，每份3 g，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行含量測定，進(jìn)樣量5 μL，利用外標(biāo)法計(jì)算各生物堿含量。結(jié)果見表4。

表4 13批山豆根樣品中4種成分的含量測定結(jié)果（n＝2）

2.5 聚類分析

聚類分析是一種對一個數(shù)據(jù)，即可以對變量（指標(biāo)）進(jìn)行分類（相當(dāng)于對數(shù)據(jù)中的列進(jìn)行分類），也可對觀測值（事件、樣品）進(jìn)行分類（相當(dāng)于對數(shù)據(jù)中的行進(jìn)行分類）的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。聚類分析首先確定變量，再通過統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離或者類與類之間的距離將不同的樣本分為幾類，并且生成相應(yīng)的樹狀圖，從而實(shí)現(xiàn)對樣本的分類。

本試驗(yàn)中對13個產(chǎn)地山豆根中的 4種生物堿含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[3]，將13個產(chǎn)地進(jìn)行了歸類。采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)分析軟件，以4種生物堿含量為變量，采用離差平方和法（ward法）對不同產(chǎn)地的山豆根藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)閾值為2時(shí)，13個產(chǎn)地的山豆根被分為3組，S1（廣西百色1）、S6（廣西環(huán)江下南鄉(xiāng)）、S2（廣西百色 2）、S3（廣西百色 3）為Ⅰ組，S4（廣西金城江五圩鎮(zhèn)）、S13（云南羅平）、S12（廣西那坡）、S5（廣西金城江九圩鎮(zhèn)）為Ⅱ組，S7（廣西環(huán)江水源）、S11（廣西靖西）、S8（廣西東蘭縣）、S9（云南 1）、S10（云南2）為Ⅲ組。

圖3 13批山豆根藥材聚類樹狀圖

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

曾考察水浴回流提取與超聲提取兩種方法，結(jié)果表明兩者的測定結(jié)果無顯著性差異，但超聲提取更簡單易行，故選用超聲法提取。比較甲醇 -鹽酸（調(diào) pH為0.5）、65% 乙醇 - 鹽酸（調(diào) pH 為 0.5）、乙醇 - 鹽酸（調(diào)pH為0.5）3種混合溶液的提取效率，結(jié)果乙醇-鹽酸（pH 0.5）的提取效率較低，且甲醇 -鹽酸（調(diào) pH為0.5）和 65%乙醇 -鹽酸（調(diào) pH 為 0.5）的提取效率無顯著性差異，但考慮甲醇毒性較大，因此選用65%乙醇-鹽酸（調(diào)pH為0.5）混合溶液作為提取溶劑。同時(shí)，考察了超聲時(shí)間（20，30，40 min）對提取效率的影響。最終選擇以65%乙醇-鹽酸（調(diào)pH為0.5）為提取溶劑，超聲提取30 min為供試品制備方法。

3.2 色譜柱、流動相及檢測波長選擇

考察 Zorbax SB C18柱、Welch Ultimate XB-NH2柱對待測成分的分離效能，結(jié)果表明，使用Zorbax SB C18柱可獲得平穩(wěn)的基線，且各待測成分的峰形良好，故選用該色譜柱為分離柱。利用Waters公司的PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)4種成分于215 nm波長處有均有較大吸收，因此檢測波長為215 nm。同時(shí)，考察了乙腈 - 甲酸（0.2% ）、甲醇 - 甲酸（0.2% ）、甲醇 - 磷酸（0.2% ）、甲醇 -0.2% 磷酸（用三乙胺調(diào) pH 為 5.0），結(jié)果表明，使用甲酸于215 nm波長處基線嚴(yán)重漂移，因此最終選擇甲醇-0.2%磷酸（用三乙胺調(diào)pH為5.0）。

3.3 測定結(jié)果分析

本研究中對不同產(chǎn)地的山豆根進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明，除S8號產(chǎn)地（廣西東蘭縣）的苦參堿和氧化苦參堿總量低于2015年版《中國藥典（一部）》對于山豆根藥材中苦參堿和氧化苦參堿的總含量要求(苦參堿和氧化苦參堿的總量≥0.7%)，其余12個產(chǎn)地的山豆根的苦參堿和氧化苦參堿的含量在0.78% ～1.62%之間，符合藥典規(guī)定。造成S8號（廣西東蘭縣）的含量低于規(guī)定這一結(jié)果的原因，可能是實(shí)驗(yàn)過程中的操作和測量誤差導(dǎo)致的測定含量低于實(shí)際含量。13個產(chǎn)地的山豆根基本符合本中國藥典的質(zhì)量要求。苦參堿和氧化苦參堿總量大于1.00%的產(chǎn)地大部分為廣西，與廣西為山豆根的道地產(chǎn)區(qū)這一事實(shí)相符合，且苦參堿與氧苦參堿的含量呈“此消彼長”[4]。聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地對山豆根生物堿的含量影響較大，不同分組的產(chǎn)地區(qū)分不明顯，可能是由于產(chǎn)地?cái)?shù)量有限的原因?qū)е拢崾緫?yīng)該增加樣本的產(chǎn)地、批次以獲取更為準(zhǔn)確客觀的研究結(jié)果。

3.4 不足之處

山豆根為有毒中藥，生物堿部分既是其有效成分，又是其毒性成分[5-7]。本研究中通過探索建立了HPLC法同時(shí)測定4種生物堿含量的方法，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對產(chǎn)地進(jìn)行聚類分析，為山豆根藥材的質(zhì)量控制提供了參考，但同時(shí)針對山豆根毒性評價(jià)的研究相對較少，尤其是能用于高通量篩選的動物模型更為缺乏，關(guān)于其毒性的時(shí)-效關(guān)系、量-效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：27.

[2]郭 智.基于UPLC-ESI-QTof的山豆根、苦參化學(xué)成分比較及柴胡不同提取方法柴胡皂苷 a、d變化的研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2014.

[3]陸國壽，葉 勇，盧文杰，等.多葉越南槐中苦參堿與氧化苦參堿的分離鑒定及含量測定研究[J].廣西醫(yī)學(xué)，2014(8):1109-1112.

[4]田婷婷，馬英華，解偉偉，等.LC-MS／MS同時(shí)測定藍(lán)萼香菜中4種二萜類成分及其聚類分析[J].中國中藥雜志，2016，41(2):250-256.

[5]韓馥蔓，王莉鑫，陳 影，等.HPLC同時(shí)測定山豆根中7種生物堿及 3種黃酮的含量[J].中國中藥雜志，2016，41（24）：4628-4634.

[6]鄭麗娜，孫 虎，謝元璋，等.山豆根化學(xué)成分與功效、毒性相互關(guān)系的研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2011，13(3):205-209.

[7]丁佩蘭.山豆根和苦參化學(xué)成分的比較研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2004.

Simultaneous Determination of Four Alkaloids in Radix et Rhizoma Sophorae Tonkinensis by HPLC and Cluster Analysis

Cheng Qian1,Zou Qinwen2,Wang Jianfen1,Han Hongyuan1,Liu Wenxue1,Xu Kexin1,Kang Shuai3,Ma Zhiqiang1,Lin Ruichao1
(1.Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China 100102;2.Beijing Lianxin Pharmaceutical Co.,Ltd.,Beijing,China 102600; 3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China 100050)

ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneous determination of matrin,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine in Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis.Methods The Agilent Zorbax SB C18column(150 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted with methanol(A)-0.2% phosphoric acid solution(B)(adjusted pH ＝ 5.0 by triethylamine)as mobile phase in gradient elution.The flow rate was 1 mL ／min and detection wavelength was 215 nm,the column temperature was 30 ℃.Results The linear ranges of matrin,oxymatrine,sophocarpine and oxysophocarpine were 31.40-2 910.47 μg ／mL,28.70-164.53 μg ／mL,50.16-813.43 μg ／mL,71.43-4 300.00 μg ／mL(r≥0.999 0),the average percentages of recovery were in the range of 100.41% to 101.23% with the RSD between 1.82% to 2.16%(n ＝ 6).Conclusion This method is simple,accurate and repeatable.The content of 4 alkaloids in different habitats is different,and the content of four alkaloids in geo-authentic habitats of Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis was relatively high.

HPLC;Radix et Rhizoma Sophorae tonkinensis;alkaloid;content determination;cluster analysis

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)17－0010－04

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.003

2015年中央公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“中藥飲片質(zhì)量保障體系研究(一)”[201507002]。

程錢，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴帣z驗(yàn)與分析，（電子信箱）1398523251＠qq.com。

林瑞超，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評價(jià)研究，（電話）010-84738653（電子信箱）linrch307＠sina.com。

2017－05－09)