中空纖維離心超濾法研究乙醇對氨茶堿游離藥物濃度的影響

周齊齊，高敬林，王新宇，杜朝輝，李夢嬌，馬海艷，蔣 曄

（河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017）

中空纖維離心超濾法研究乙醇對氨茶堿游離藥物濃度的影響

周齊齊，高敬林，王新宇，杜朝輝，李夢嬌，馬海艷，蔣 曄

（河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017）

目的探討乙醇對氨茶堿游離藥物濃度的影響。方法 采用中空纖維離心超濾（HFCF-UF）前處理技術結合高效液相色譜（HPLC）法對氨茶堿游離藥物濃度進行測定，并比較乙醇加入前后游離藥物濃度的變化。結果 加入乙醇后氨茶堿游離藥物濃度增加，且血漿乙醇濃度與游離藥物濃度呈線性相關關系。結論 加入乙醇可能會影響血漿中的氨茶堿與血漿蛋白的結合，游離藥物濃度增加，易出現毒副作用及毒性反應。

中空纖維離心超濾；乙醇；氨茶堿；游離藥物濃度

血液中的藥物通常以2種形式存在，部分與血漿蛋白結合，部分呈游離狀態[1]。只有未與血漿蛋白結合的游離藥物才是體內真正發揮藥理效應的部分，其與藥效及不良反應直接相關，尤其對于治療窗窄、毒性大、蛋白結合率高的藥物至關重要[2-3]。游離藥物濃度極易受到多種因素的影響，目前僅關注疾病狀態、合并用藥等的影響[4]，而人們的日常生活習慣如吸煙、飲酒等的影響較易被忽視。氨茶堿(aminophylline，APY)為臨床常用支氣管擴張劑，其治療窗窄(10 ～20 μg ／mL)，易出現毒副反應[5]，酒精中毒者慎用氨茶堿藥物[6]，因此，本研究以氨茶堿為例，采用中空纖維離心超濾（HFCF-UF）技術結合高效液相色譜（HPLC）法對氨茶堿游離濃度進行測定，并進一步研究不同血漿乙醇濃度對游離藥物濃度的影響規律，為藥效的增強及藥品不良反應的控制提供理論依據。

1 儀器與試藥

UItiMate 3000型液相色譜儀，VWD-3100型紫外檢測器(美國戴安公司)；H1650型臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海化科實驗器材公司)；聚砜中空纖維(天津膜天膜科技股份有限公司，壁厚150 μm，截留相對分子質量10×103)；超濾玻璃管(天津永達儀器化工公司，高度7 cm，內徑3 cm)。氨茶堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100121-201104)；無水乙醇（天津永達化學試劑有限公司）；空白血漿由河北省人民醫院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agela Innoval C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm Dikma)；流動相：甲醇 -0.01mol／L 醋酸銨（15∶85）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：274 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液配制

將 0.067 mol／mL 磷酸氫二鈉溶液和 0.067 mol／mL的磷酸二氫鈉溶液按4∶1的體積混合，加入適量氯化鈉，使氯化鈉濃度為 0.15 mol／mL，并用磷酸調 pH ＝7.4，得磷酸緩沖溶液(PBS)。

取氨茶堿對照品 5.06 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用PBS稀釋至刻度，得506 μg／mL的標準貯備液。將標準貯備液用PBS逐步稀釋得質量濃度分別為25.300，10.100，5.050，2.020，1.010，0.505 μg ／mL 的系列標準溶液；同時制備 25.300，5.050，0.505 μg ／mL的質控血漿樣品溶液。

2.3 血漿樣品處理

將中空纖維剪成15 cm的小段，對折插入離心管中，另取血漿樣品500 μL，置HFCF-UF裝置中，37℃，3 500 r／min條件下離心15 min，取中空纖維內液20 μL，直接進樣分析，得氨茶堿的游離藥物濃度。

研究乙醇對氨茶堿游離藥物濃度的影響時，取血漿樣品 450 μL，置 1.5 mL 離心管中，分別加入 50 μL 不同質量濃度的乙醇溶液(5.00，10.00，50.00，100.00，250.00，500.00 g／L)，渦旋，制得質量濃度分別為 0.50，1.00，5.00，10.00，25.00，50.00 g ／L 的不同血漿乙醇濃度的樣品溶液，置HFCF-UF裝置中，3 500 r／min離心15 min，取中空纖維內液，直接進樣分析。

2.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。散點圖用于描述氨茶堿游離藥物濃度與血漿乙醇濃度的關系。

2.5 方法學考察

特異性試驗：氨茶堿標準溶液、空白血漿及質控樣品按2.3項下方法處理后，進樣分析。在擬訂色譜條件下，氨茶堿與血漿內源性雜質分離良好，不受內源性雜質的干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取2.2項下系列標準溶液各20 μL，進樣分析，以氨茶堿相應峰面積(A)與質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程 A＝0.365 1 C+0.008 3，R2＝0.999 9(n ＝6)。結果表明，氨茶堿質量濃度在 0.505 ～25.300 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取線性最低點標準溶液逐倍稀釋，按擬訂色譜條件測定，以信噪比(S／N)為3和10計，計算氨茶堿的檢測限和定量限，結果分別為0.202 μg ／mL 和 0.505 μg ／mL。

精密度試驗：取 2.2 項下質量濃度為 0.505，5.050，25.300 μg／mL的質控血漿樣品溶液，每個質量濃度制備5份，按血漿樣品處理項進行操作，記錄色譜峰面積，依法計算方法的回收率。以所得峰面積計算日內精密度；每個濃度連續測定5 d，計算日間精密度。結果表明，低、中、高 3個質量濃度的方法回收率為 98.2%～100.8%，日內、日間精密度的 RSD均小于2.3%(n＝5)。詳見表1。

表1 HFCF-UF法測定氨茶堿游離藥物濃度的回收率及精密度試驗結果(n＝5)

穩定性試驗：取 0.505，5.050，25.300 μg ／mL 3 個質量濃度的質控血漿樣品溶液各5份，分別考察其置于室溫下24 h及-70℃條件下保存3個月、3次凍融循環，以及經血漿樣品處理后的超濾液在室溫條件下放置24 h后的穩定性。結果的 RSD均小于7.5%(n＝5)，表明質控血漿樣品溶液在上述條件下穩定性良好。

2.6 不同血漿乙醇濃度對氨茶堿游離藥物濃度的影響

取適量氨茶堿標準品及空白血漿溶液，渦旋混勻，得 10.0 μg／mL 和 20.0 μg／mL 的質控血漿樣品溶液。按2.3項下方法制備不同血漿乙醇濃度的質控血漿樣品溶液，置超濾離心管中，3 500 r／min離心 15 min，超濾液進樣分析，不同乙醇濃度重復5份，依法測定。由圖2可知，在體外條件下，乙醇的加入可使氨茶堿游離藥物濃度增加；血漿乙醇濃度與氨茶堿游離藥物濃度呈正相關性，10.0 μg ／mL 和 20.0 μg／mL 的質控樣品溶液，r分別為 0.993 和 0.997(P ＜0.000 1)。氨茶堿質控血漿樣品(10.0 μg ／mL），隨著血漿乙醇濃度從 0 增至

50 g／L，其相應的游離藥物濃度增加1倍，接近氨茶堿游離藥物濃度的有效治療濃度最大值(8.00 μg／mL)，

不良反應的發生率增加；氨茶堿濃度為20.0 μg／mL的質控血漿樣品溶液，其游離藥物濃度本身為有效治療濃度的最大值，乙醇加入量稍微增加，即使氨茶堿游離藥物濃度超過有效治療范圍，出現了毒副反應。

圖2 血漿乙醇濃度與氨茶堿游離藥物濃度的相關性結果

3 討論

3.1 乙醇對氨茶堿游離藥物濃度的影響

飲酒往往會影響藥物療效，有時甚至增加藥物的毒副作用[7-9]。文獻[10-11]從乙醇影響藥物代謝酶活性方面部分地闡釋了乙醇對藥物療效及不良反應的影響機制，但人體對藥物的處置較復雜，單從酶代謝方面闡述乙醇對藥物的影響還不全面。賈昊迪等[12]報道了乙醇對綠原酸與牛血清白蛋白相互作用的影響，指出藥物與白蛋白的結合常數和結合位點數均隨著乙醇含量的增大而增加；閆華等[13]報道了乙醇對肉桂酸及黃酮類化合物與牛血清白蛋白結合的影響，指出乙醇的加入使結合常數和結合位點數減小。因此，乙醇進入機體后，可對肝微粒體藥物代謝酶活性、藥物-蛋白結合及對器官與組織的作用等多方面產生影響，使藥物濃度及游離藥物濃度發生變化，而游離藥物濃度與毒副作用及不良反應有直接相關性。本研究結果表明，乙醇的加入可使氨茶堿游離藥物濃度增加，同時血漿乙醇濃度與氨茶堿游離藥物濃度呈正相關。血漿中游離藥物濃度增加，不良反應的發生率增加，乙醇會影響藥物的蛋白結合，從而影響藥物的游離濃度，建議服藥人群盡量避免飲酒。

3.2 乙醇加入量的選擇

血中乙醇含量≥80 g ／100 L 時為醉酒狀態[12，14]。同時，考慮到乙醇在機體內與藥物的相互作用復雜，藥物總濃度及游離濃度的變化可能受肝微粒體藥物代謝酶、藥物-蛋白結合及器官與組織等多方面因素影響。為了在體外條件下更好地觀察乙醇濃度對游離藥物濃度的影響規律，本研究中考察了大范圍的乙醇加入量(0～50 g／L)。結果顯示，血漿乙醇濃度與氨茶堿游離藥物濃度呈正相關性，乙醇加入量的增加，使氨茶堿游離藥物濃度增加，易發生毒副作用及毒性反應，提示飲酒量對藥物療效的影響，從而約束服藥人群的飲酒行為。

3.3 非特異性結合(NSB)

NSB是膜超濾法常見的現象，可導致測定結果失真，因此考察了中空纖維對氨茶堿的NSB。取2.2項下低、中、高3個質量濃度的標準溶液，將500 μL該溶液置超濾管中，分別用聚偏氟乙烯、聚砜、聚酰胺3種材質的中空纖維在3 500 r／min下離心15 min，吸取中空纖維內液及外液20 μL進樣，測得結果與同濃度的標準溶液比較，以回收率為指標。結果表明，3種材質的中空纖維所得內外溶液的回收率均在98.4%以上，故均不存在NSB問題。最終選用聚砜中空纖維用于后續試驗。

3.4 研究價值

乙醇對血漿中氨茶堿游離藥物濃度的影響規律，隨著乙醇濃度的增高，游離藥物濃度呈線性增加。本研究結果表明，藥物與血漿蛋白的結合可能受到乙醇等因素的影響，蛋白結合率降低的同時游離藥物濃度增大。對于治療窗窄、毒性大且蛋白結合率高的藥物，蛋白結合率微小變化就會引起游離濃度很大的變異，而游離藥物濃度與藥效及毒副作用直接相關。因此，研究乙醇對治療窗窄、毒性大且蛋白結合率高的藥物游離濃度的影響，對于藥理學研究具有重要意義。

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Effects of Alcohol on Free Drug Concentration of Aminophylline by Hollow Fiber Centrifugal Ultrafiltration

Zhou Qiqi,Gao Jinglin,Wang Xinyu,Du Chaohui,Li Mengjiao,Ma Haiyan,Jiang Ye
(School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei,China 050017)

ObjectiveTo investigate the effect of alcohol on free drug concentration of aminophylline.Methods Hollow fiber centrifugal ultrafiltration(HFCF-UF)combined with HPLC was adopted to determine the free drug concentration of aminophylline.The difference in free concentration before and after alcohol adding into the plasma was further compared to explore the impact on it of different alcohol concentrations.Results The free drug concentration of aminophylline increased with the addition of alcohol,meanwhile,there was a linear relationship between it and the alcohol concentration in plasma.Conclusion The addition of ethanol may affect the binding rate of aminophylline and plasma proteins in plasma,increase the free drug concentration,and prone to side effects and toxicity.

hollow fiber centrifugal ultrafiltration(HFCF-UF);alcohol;aminophylline;free drug concentration

R965；R969.2；R974+.3

A

1006-4931(2017)17-0014-03

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.004

河北省省級大學生創業創新訓練項目[USIP201533A]。

周齊齊（1994- ），女，大學本科，研究方向為藥學，（電子信箱）785621123＠ qq.com。

蔣曄（1961-），男，教授，碩士研究生導師，研究方向為藥物的質量控制，(電話)0311-86266069(電子信箱)jiangye＠hebmu.edu.cn。

2017－05－09)