高效液相色譜法測定肝炎康膠囊中槲皮素含量

韋亞潔 ，李 平 ，2 ，秦 龍

（1.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

高效液相色譜法測定肝炎康膠囊中槲皮素含量

韋亞潔1，李 平1，2，秦 龍1

（1.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

目的建立測定肝炎康膠囊中槲皮素含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇 -0.1%磷酸（53∶47），流速為 1.0 mL／min，柱溫為 30℃，檢測波長為 360 nm，進樣量為 5 L。結果 槲皮素質量濃度在 3.7 ～236.8 g／mL（r＝0.999 9）范圍內與峰面積線性關系良好，平均回收率為 99.79% ，RSD 為 0.82% （n＝6）。結論 該方法準確性高、專屬性強、重復性好，可用于肝炎康膠囊的質量控制。

肝炎康膠囊；槲皮素；高效液相色譜法

肝炎康膠囊是在我院常年使用的臨床固定方基礎上開發的醫療機構制劑，由虎杖、黃芪、太子參、半枝蓮、白花蛇舌草、丹參、柴胡、水紅花子等8味藥材經水煎提取、干燥工藝制成的中藥膠囊劑，具有益氣固本、活血化瘀、利濕解毒的功效，主要用于治療肝炎。其已建立了較為完善的質量標準體系，包括除水紅花子外的7種藥味的薄層色譜鑒別及大黃素的含量測定方法[1]。本制劑組方中白花蛇舌草、黃芪和水紅花子均含有槲皮素（quercetin），且其活性與本制劑的臨床主治相關。本研究中以槲皮素為檢測指標，建立測定肝炎康膠囊中槲皮素含量的高效液相色譜（HPLC）法，擬在其質量標準中建立大黃素和槲皮素雙成分含量限度指標，為進一步提高制劑的質量控制水平提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Mettler AB135-S型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆侖超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為10081-201610）；肝炎康膠囊（蘭州大學第二醫院自制制劑，批號為20170205）；藥材由甘肅隴脈藥材有限公司提供，經甘肅省中醫藥大學李成義教授鑒定與檢驗，均符合2015年版《中國藥典（一部）》及相關地方藥材標準規定。甲醇（色譜純，山東禹王實業有限公司禹城化工廠）；磷酸（分析純，北京紅星化工廠）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2-4]

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；進樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取槲皮素對照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含370 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品內容物適量，混勻，研細，取約1.24 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為160 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：參照肝炎康膠囊處方及制法，依法制成缺白花蛇舌草、黃芪、水紅花子的陰性供試樣品，按供試品溶液項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各5 μL，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在與供試品溶液相同保留時間處未出現色譜峰，表明陰性對照品溶液無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密量取槲皮素對照品溶液0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 mL，分別置 5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液。分別精密吸取各5 μL進樣，以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝8.255 0 X-24.180， r＝0.999 9（n＝7）。結果表明，槲皮素質量濃度在 3.7 ～236.8 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液各5 μL，在擬訂色譜條件下連續進樣6次。結果峰面積的平均值為60.322 2，RSD 為 1.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液各5 μL，分別于 0，1，2，3，4，5，6 h 時進樣。結果槲皮素峰面積的平均值為 60.184 4，RSD 為 1.81% （n＝7），表明供試品溶液在6 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為20170205）的6份樣品，每份約1.24 g，按供試品溶液制備方法制備，在擬訂色譜條件下分別進樣各5 μL，測定峰面積并計算槲皮素含量。結果肝炎康膠囊中槲皮素的平均含量為0.415 mg／g， RSD 為 1.88% （n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的肝炎康膠囊（批號為 20170205，含量為 0.415 mg／g）供試品溶液 6 份，分別按其槲皮素含量的80%，100%，120%精密加入槲皮素對照品溶液，搖勻。精密吸取上述溶液各5 μL，分別進樣，測定峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗結果(n＝6)

3 討論

3.1 流動相考察

因加入適量的酸可以抑制槲皮素色譜峰的拖尾現象，故選用甲醇-磷酸體系。在參照文獻[2-4]色譜條件的基礎上，分別對甲醇 -0.1%磷酸（80∶20）、甲醇 -0.1% 磷酸（60 ∶40）、甲醇 -0.1% 磷酸（57 ∶43）、甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）、乙腈 -0.1% 磷酸（75 ∶25）和乙腈-0.1%磷酸（40∶60）等流動相體系進行比較。結果表明，在甲醇 -0.1%磷酸（53∶47）流動相下，色譜中槲皮素峰與相鄰共存物質峰的分離度良好，峰形佳，槲皮素峰與相鄰共存物質峰的分離度（R）均大于1.5，陰性無干擾。

3.2 柱溫考察

對 25，30，35，40℃等不同柱溫進行考察，結果表明，30℃時槲皮素與相鄰共存物質峰能很好地分離且出峰較快，最終確定柱溫為30℃。

3.3 樣品處理方法考察

由于肝炎康膠囊內容物為水提取物，故選用供試樣品加甲醇超聲處理（功率為160 W，頻率為50 kHz）30 min的方法處理樣品。分別超聲處理 15，30，45 min，按擬訂色譜條件檢測，結果表明，30 min時肝炎康膠囊中的槲皮素已提取較完全，故確定超聲處理時間為30 min。

3.4 研究價值

建立肝炎康膠囊中槲皮素的含量測定方法，是基于多指標控制制劑質量的理念，即在已建立大黃素含量限度基礎上增加槲皮素的含量測定項，提高質量控制水平。隨著今后樣品批次的增加和檢測數據的累積，將進一步對槲皮素的含量限度進行研究和確定，加強對其質量標準的更新。

[1]王娟弟，李 平，秦 龍，等.肝炎康膠囊質量標準的建立[J].中國藥師，2015，18（4）：559-663.

[2]白吉慶，王小平，李文連.青翹果實不同部位的有效成分比較分析研究[J].中成藥，2012，34（3）：582-585.

[3]貝偉劍，羅 杰，吳愛鑾，等.HPLC法測定柿葉浸膏中槲皮素和山奈酚[J].中草藥，2005，36（7）:1014-1015.

[4]石繼亮，單 玉，張振秋，等.HPLC法測定黃芪中槲皮素、山奈酚、芒柄花素的含量 [J].藥物分析雜志，2010，30（1）：114-116.

Content Determination of Quercetin in Ganyankang Capsules by HPLC

Wei Yajie1,Li Ping1,2,Qin Long1
(1.Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou,Gansu,China 730030;2.Key Laboratory of Digestive System Tumors,Lanzhou,Gansu,China 730030)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of quercetin in Ganyankang Capsules.Methods The Zorbax Eclipse XDB-C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted with the mobile phase of methanol-0.1%H3PO4(53 ∶47)at flow rate of 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 360 nm,the injection volume was 5 μL.Results The linear range of quercetin was 3.7-236.8 μg ／mL(r＝ 0.999 9)with an average recovery of 99.79%,RSD ＝0.82%(n ＝ 6).Conclusion The method is accurate,specific and reproducible,which can be used for the quality control of quercetin in Ganyankang Capsules.

Ganyankang Capsules;quercetin;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)17－0021－03

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.006

甘肅省自然科學基金[145RJZA207]；蘭州大學第二醫院2015年度院內博士基金[ynbskyjj2015-2-17]；蘭州大學第二醫院院內中醫藥科研項目[YJzy2013-26]。

韋亞潔，女，大學本科，副主任藥師，講師，研究方向為臨床藥學與中藥制劑質量控制，（電話）0931-8942627（電子信箱）yajiewei＠ 163.com。

李平，男，博士研究生，碩士研究生導師，主任藥師，研究方向為藥物制劑，（電子信箱）gsliping＠163.com。

2017－05－16；

2017－06－28)