ERK1/2信號通路對缺血后適應大鼠皮層的作用

譚慧敏 鄭興榮 譚 盛

1)廣州市增城區新塘醫院內一科，廣東 廣州 511340 2)南方醫科大學第二臨床醫學院 珠江醫院神經內科，廣東 廣州 510282

·論著科研之窗·

ERK1/2信號通路對缺血后適應大鼠皮層的作用

譚慧敏1)鄭興榮1)譚 盛2)

1)廣州市增城區新塘醫院內一科，廣東 廣州 511340 2)南方醫科大學第二臨床醫學院 珠江醫院神經內科，廣東 廣州 510282

目的研究腦缺血大鼠缺血后適應模型中大腦皮質的ERK1/2通路表達特點及應用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后對缺血后適應神經保護作用的影響，研究缺血后適應是否通過ERK1/2信號通路介導對急性缺血性腦梗死再灌注后的神經保護作用。方法將20只SD大鼠隨機分為假手術組、缺血 2 h 再灌注組、缺血 2 h 后適應組以及PD98059+缺血 2 h 后適應組(PD+2 h 后適應組)，每組5只，用線栓法建立急性大腦中動脈閉塞的缺血性腦梗死模型，4組分別進行不同形式的實驗。對比4組大鼠再灌注1 h、24 h的神經功能評分及再灌注24 h后的梗死體積。每組另增加15只大鼠，分別于再灌注后2 h、6 h、24 h留取缺血大腦皮質；Western blot檢測再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達。結果PD+2 h后適應組與缺血2 h再灌注組神經功能缺損評分高于缺血2 h后適應組，腦梗死體積大于缺血2 h后適應組。缺血后適應組再灌注2 h、6 h、24 h后P-ERK1/2表達明顯高于缺血2 h再灌注組及PD+2 h后適應組；以上表明，缺血后適應通過ERK1/2信號通路減輕大鼠缺血性腦損傷，應用P-ERK1/2的阻滯劑PD98059后，阻斷了缺血后適應的腦保護作用。結論通過對本實驗研究數據的分析后發現，缺血后適應對大鼠急性缺血性腦梗死具有神經保護作用，應用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，缺血后適應神經保護效應減弱，說明缺血后適應對急性缺血性腦梗死再灌注損傷的保護作用與MAPK/ERK信號通路具有深層次緊密關系。

后適應；ERK1/2；PD98059；神經保護；腦缺血

急性缺血性腦卒中已成為我國乃至全世界最具威脅性的一種疾病[1]。筆者通過實驗研究數據分析認為，缺血后適應對大鼠急性腦梗死缺血再灌注損傷具有保護作用，而具體的作用機制尚未明確。另一方面，已知細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2)介導的信號轉導通路是多種刺激的共同通路，也是目前腦缺血再灌注損傷研究的熱點。但缺血后適應與腦保護的關系是否與此通路相關？本課題擬通過蛋白印跡等方法研究ERK1/2在缺血后適應大鼠缺血皮層的信號表達特點，及應用ERK1/2特異性抑制劑PD98059阻斷ERK1/2通路，觀察其對缺血后適應的神經保護作用的影響，進一步探索MAPK/ERK通路在缺血后適應對腦缺血再灌注后發揮保護作用的機制，力圖尋找相關調控靶點進行干預，達到調控病理狀態下內源性神經保護機制的目的，為尋找更好的腦保護途徑提供依據。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實驗動物：健康成年雄性SD大鼠，由南方醫科大學實驗動物中心提供。

1．1．2 主要試劑及儀器：氯化-2，3，5三苯基四氮唑(TTC)染色劑，購自美國Tocris Cookson公司，計算機圖像分析系統(南方醫科大學)；線栓：4-0尼龍單線，由北京沙東生物技術有限公司提供?？?ERK1/2(T-ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司。ERK1/2上游激酶抑制劑PD98059購自Cell Signaling公司。

1．2方法

1．2．1 模型的建立及分組：本研究采用線栓法建立急性右大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的缺血性腦梗死模型[1]，見圖1。設立假手術組、缺血2 h再灌注組、缺血2 h后適應組、PD98059+缺血2 h后適應組，每組5只SD大鼠。①假手術組：在尼龍線小球端插入至大腦中動脈起始端后，立即拔出。②缺血 2 h 再灌注組：于缺血2 h后實現再灌注。③缺血 2 h 后適應組：于缺血2 h后再灌注即刻進行缺血后適應即雙側頸總動脈10 s/10 s夾閉/開放5個循環，隨后恢復動脈血流。④PD+2 h后適應組：在③的方法下同時將PD98059經尾靜脈注入大鼠體內。其他3組予以生理鹽水經尾靜脈注入大鼠體內干預。各組分別于再灌注后1 h和24 h給予神經功能評分，24 h神經功能評分后直接斷頭取腦，用切片刀沿冠狀切面取視交叉處切第一刀，向前均勻切3張切片，向后均勻切2張切片，做2 mm厚的冠狀切片，將腦組織切片置于濃度為2%的TCC染液中，避光37 ℃孵育30 min，紅色部分為正常腦組織，白色部分為梗死灶。數碼相機拍照后，由未參與本次研究的工作人員應用病理圖文分析軟件測量梗死面積，算出梗死體積，見圖2。每組另外增加15只大鼠，分別于再灌注后2 h、6 h、24 h，用10%水合氯醛將大鼠深度麻醉，心臟生理鹽水灌注速取大腦，在冰盤中分離出右側腦組織，取Bremga+1.0 mm～Bremga-3.0 mm間的缺血腦皮質凍存于液氮中，以備使用；Western blot檢測再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達。

圖1 大鼠急性大腦中動脈閉塞模型

圖2 氯化-2、3、5三苯基四氮唑(TTC)染色 梗死灶呈白色，正常腦組織呈紅色 A：缺血2 h后適應組 B：缺血2 h再灌注組 C：PD+2 h后適應組

1．2．2 觀測指標：①神經功能缺損評分：采用神經行為評分法評價，具體項目包括自主活動的程度、左前支偏癱、提尾時左前肢伸不直、抗側推能力、向左傾斜度、向左環行度、對觸須的反應，每個項目的評分范圍均為0～2分(無異常、中等異常、嚴重異常)，總分為14分，評分越高神經功能缺損越嚴重。②腦梗死體積測定：具體測定方法為計算未梗死側面積和腦梗死側未梗死面積之差，得出結果即為梗死面積，各切面正反兩面的梗死灶面積之和除以2所得平均值再乘以厚度即為每個冠狀面的梗死灶體積的近似值，5個冠狀面的梗死灶體積相加之和即為大鼠最終的腦梗死體積。③Western blot檢測再灌注2 h、6 h、24 h后總T-ERK1/2、P-ERK1/2表達：取液氮保存后右腦皮質組織，用PBS沖洗組織，加入SDS樣品緩沖液，100 ℃加熱5 min，室溫下離心，取上清液，用醋酸纖維膜作為固相支持物進行蛋白質的電轉移；用5%去脂奶粉作為封閉液；加入T-ERK1/2、P-ERK1/2單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜進行反應，其后加入HRP標記的二抗(1∶2 000)；最后顯色。用圖像分析儀進行總T-ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達的半定量分析，觀察缺血后2 h、6 h、24 h上述指標的變化。

2 結果

2．1神經功能缺損評分假手術組大鼠無神經功能缺損體征，腦缺血組出現明顯的神經功能缺損表現。神經

功能缺損評分采用重復測量的方差分析；缺血再灌注不同時間點之間，各處理組間，神經功能缺損評分有顯著差異(F值分別為46.32、25.35，均P<0.000)。再灌注后1 h神經功能評分3組比較差異無統計學意義(P>0.05)，再灌注后24 h神經功能評分3組差異具有統計學意義(P<0.05)。缺血2 h后適應組神經功能缺損評分顯著低于缺血2 h再灌注組及PD+2 h 后適應組，提示缺血后適應能減輕大鼠急性缺血性腦梗死再灌注后所產生的神經功能缺損，ERK1/2上游激酶抑制劑PD98059可削弱缺血后適應的這種腦保護作用。見表1。

表1 3組大鼠再灌注后1 h、24 h的神經功能評分分析

2．2腦梗死體積缺血2 h后適應組腦梗死體積小于缺血2 h再灌注組及PD+2 h后適應組(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠再灌注后24 h的腦梗死體積比較

2．3 T-ERK及P-ERK1/2表達特點Western blot檢測結果顯示，假手術組大鼠腦皮質內P-ERK1/2活化不明顯，再灌注2 h、4 h和 6 h后，缺血2 h再灌注組和缺血2 h后適應組均可見P-ERK1/2表達增多(P<0.05)；但缺血2 h后適應組的P-ERK1/2表達明顯強于缺血2 h再灌注(P<0.05)。而PD98059+缺血2 h后適應組的P-ERK1/2表達明顯低于缺血2 h后適應組，說明PD98059能夠抑制缺血后適應所引起的P-ERK1/2增加，缺血后適應的神經保護效應與ERK1/2的磷酸化激活有關，而各組間 T-ERK水平無明顯差異(P>0.05)。見圖3、圖4。

圖3 3組再灌注各時間點P-ERK1/2、T-ERK1/2 Western blot結果 1假手術組；2缺血2 h后適應組再灌注；3缺血2 h再灌注組再灌注2 h；4 PD+2 h后適應組再灌注2 h；5缺血2 h后適應組再灌注6 h；6 缺血2 h再灌注組再灌注6 h；7 PD+2 h后適應組再灌注6 h；8缺血2 h后適應組再灌注24 h；9缺血2 h再灌注組再灌注24 h；10PD+2 h后適應組再灌注24 h

圖 4 各組再灌注2 h、6 h、24 h ERK1/2磷酸化程度比較注：再灌注不同時間點，各處理組ERK1/2磷酸化程度比較，*P<0.05

3 討論

近年來，國內外均在探索腦缺血后相應的病理生理機制，以尋求神經保護措施[2-5]。缺血后適應是最近發現的一種新的干預措施，對腦組織缺血/再灌注損傷具有保護作用[6-7]。但該項干預措施的腦保護機制尚不明確。筆者的前期研究[1]也證實了缺血后適應對急性缺血性腦梗死具有保護作用，這種保護機制可能與上調Bcl-2及下調 Bax蛋白在缺血半暗帶的表達，抑制細胞凋亡有關，但 bcl-2抗凋亡的具體信號轉導機制還不明確。ERK1/2為MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)的成員之一，是MAPK級聯途徑中多種信號轉導通路的中心，近年來已有大量臨床研究證實，ERK1/2信號轉導通路與組織細胞的凋亡存在密切關系，部分學者認為，缺血后適應使ERK1/2的磷酸化水平增高，抑制細胞凋亡，故能夠發揮神經保護作用[8]。而部分學者[9-10]認為，ERK的激活可加重缺血性腦損傷?；谏鲜鲅芯楷F狀，本實驗擬通過觀察ERK1/2在缺血后適應大鼠缺血皮層中的表達，及MAPK/ERK信號通路介導的作用機制在缺血后適應對腦缺血后腦保護作用的影響，以揭示缺血后適應腦保護的機制，結果顯示，缺血后適應的腦保護作用與p-ERK1/2的表達增高有關，應用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，大腦缺血皮層ERK1/2磷酸化激活減少，缺血后適應的神經保護效應減弱，由此可認為，缺血后適應通過ERK1/2信號通路介導了對急性缺血性腦梗死再灌注后的神經保護作用，可能與上調p-ERK1/2的表達有關，提示臨床可從該方向著手尋找、確立藥物靶點，直接對MAPK/ERK信號通路進行一定的干預，為尋找減少腦缺血再灌注損傷及腦保護治療新的靶點提供依據具有重要意義。然而目前還不太清楚，P-ERK1/2的激活是否只是單一的P-ERK1/2形式，P-ERK1/2的靶點位于何處，需要進一步研究。

[1] 譚慧敏．缺血后適應對急性缺血性腦梗死再灌注大鼠神經元凋亡的影響[D]．昆明：昆明醫學院，2011．

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(收稿2017-04-22)

責任編輯：張喜民

TheeffectofERK1/2ontheischemiccortexofratsafterischemicpostconditioning

TanHuimin*，ZhengXingrong，TanSheng

*DepartmentofInternalMedicine，XintangHospitalofZengchengDistrictinGuangzhou，Guangzhou511340，China

ObjectiveTo investigate the expression of ERK1/2 in the ischemic cortex of rats after ischemic postcondition-ing and the effect of extracellular signal-regulated kinase(ERK) inhibitor PD98059 on neuroprotective effects of ischemic postconditioning．and to examine if ischemic postconditioning reduced acute ischemic cerebral infarction followed by reperfusion-induced neurological function and structure injury in rats by increasing the levels of ERK1/2．MethodsTwenty (SD) rats were randomly assigned to sham-operated group，ischemic-reperfusion group，ischemic postconditioning group and PD98059+ischemic postconditioning．We established acute middle cerebral artery occlusion (MCAO) models by using intraluminal suture method．We compared neurological deficit scores in the four groups at 1h and 24h after reperfusion．We compared infarct volume at the end of the 24-hour reperfusion．Furthermore，fifteen rats were added to each group and sacrificed at 2，6 and 24 hours after reperfusion，respectively．The phosphorylation of ERK1/2 and T-ERK1/2 in the ischemic cortex was measured by Western Blot at 2，6，24h after reperfusion．ResultsNeurological scoring and infarct volume in the group of postconditioning at 2 hours after infarction is minimum among the three groups．But the P-ERK 1/2 in the ischemic cortex of the ischemic postconditioning group were significantly increased at 2，6，24h after reperfusion than other two groups．ConclusionThrough the analysis in this experiment，we found that ischemic postconditioning plays a positive role in neuroprotection，and PD98059 could inhibit the expression of ERK in ischemic cortex and decrease the neuroprotective effects，which suggests that MAPK/ERK may participate in neuroprotection of ischemic postconditioning after ischemia/reperfusion injury．

Postconditioning；ERK1/2；PD98059；Neuroprotection；Cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.15.001

廣州市醫藥衛生科技項目(20151A011115)

譚慧敏(1979-)，女，神經病學碩士，主治醫師。研究方向：腦血管病的基礎與臨床。Email：zc123456zc@126.com

R-332

A

1673-5110(2017)15-0001-05