高效液相色譜法同時測定人尿液中布洛芬和吲哚美辛的濃度Δ

劉豐，周輝，袁泰先（1.咸寧市中醫醫院藥房，湖北咸寧437100；.重慶醫科大學藥學院，重慶400016；3.重慶醫科大學檢驗醫學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016）

·臨床藥學與研究·

高效液相色譜法同時測定人尿液中布洛芬和吲哚美辛的濃度Δ

劉豐1＊，周輝2，袁泰先3#（1.咸寧市中醫醫院藥房，湖北咸寧437100；2.重慶醫科大學藥學院，重慶400016；3.重慶醫科大學檢驗醫學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016）

目的：建立同時測定人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的方法。方法：尿液樣品經乙腈沉淀蛋白后，采用高效液相色譜法測定。色譜柱為Discovery C18，流動相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，用冰醋酸調節pH至3.5），紫外檢測波長為220 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫，進樣量為80 μL。結果：布洛芬和吲哚美辛的尿藥濃度均在0.1～50.0 μg/mL范圍內線性關系良好（r分別為0.999 6、0.999 5，n＝3），定量下限均為0.1 μg/mL，最低檢測限均為0.03 μg/mL；日內、日間RSD均小于10%（n＝5），準確度為94.7%～97.2%；布洛芬和吲哚美辛的提取回收率分別為89.5%～91.8%、90.2%～92.4%（RSD均小于10%，n＝15）。結論：該方法簡便、快速，且選擇性、精密度、準確度良好，適用于人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的同時測定。

高效液相色譜法；布洛芬；吲哚美辛；尿藥濃度

布洛芬（Ibuprofen）和吲哚美辛（Indometacin）均屬于非甾體抗炎鎮痛藥[1]。布洛芬通過強力抑制前列腺素的合成，發揮止痛和抗炎作用，臨床上主要用于治療輕中度偏頭痛、慢性風濕性關節炎、腰痛、手術后外傷及拔牙后的消炎、鎮痛等[2-3]。吲哚美辛也是強效前列腺素合成抑制劑之一，具有顯著的抗炎解熱作用，目前臨床已廣泛應用于早產兒動脈導管未閉、腎小球腎炎、原發性直立性低血壓、Batter綜合征、眼科疾患、各種腫瘤發熱和非特異性低熱等[4-5]。這兩種藥物口服后大部分經小腸吸收，在肝臟轉化，胃腸道不良反應較輕，臨床應用廣泛[6-7]。目前，臨床上常將二者合用，治療早產兒動脈導管未閉[8]。二者都具有很高的蛋白結合率，合用時可競爭結合蛋白；同時，吲哚美辛與蛋白的結合較布洛芬更穩定，可置換出已與蛋白結合的布洛芬，從而使后者的血藥濃度升高，增加不良反應發生的風險；此外，二者聯用還有可能加劇共同存在的不良反應，如胃出血、肝損害等[9]。因此，為減少不良反應發生，當兩藥聯用時有必要對患者體內的藥物濃度進行監測[10]。目前，已有多種技術可用于體內藥物監測，也有研究者對布洛芬和吲哚美辛的測定方法進行了報道，主要包括高效液相色譜（HPLC）法、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法、氣相色譜（GC）法、氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）法、毛細管電泳法、分光光度法、薄層色譜法（TLC）等，檢測的樣品以血液、尿液、動物組織為主[11-18]。為了進一步提高檢測效率，本研究嘗試建立一種無創、低成本、高靈敏度、簡便、快速的同時測定尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的方法，以期為其人體藥動學研究提供參考依據，為臨床個體化用藥提供技術支持。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，配有紫外檢測器（美國Agilent公司）；TDZ4B-WS型低速離心機（湖南賽特湘儀儀器公司）；MS3型漩渦混合器（廣州艾卡儀器設備公司）；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

布洛芬對照品（批號：17905，純度：99.7%）、吲哚美辛對照品（批號：17378，純度：99.6%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸銨為分析純，實驗用水為超純水。

1.3 空白尿液

空白尿液來源自重慶醫科大學附屬第一醫院健康體檢者，無生殖泌尿系統感染且5 d內未服用過任何藥物。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Discovery C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；保護柱：Agilent Zorbax SB-C18（12.5 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，用冰醋酸調節pH至3.5）；紫外檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：80μL；整個分析流程共10 min。

2.2 溶液的配制

取布洛芬和吲哚美辛對照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容，得質量濃度均為1 mg/mL的混合對照品貯備液，置于4℃冰箱中保存。取上述貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用乙腈定容，得質量濃度均為100 μg/mL的標準工作液，備用。

2.3 尿液樣品的處理

取空白尿液100μL，加入乙腈1 mL，渦旋振蕩2 min，以離心半徑10.5 cm、轉速4 200 r/min離心10 min后，取上清液，置于另一試管中，以氮氣流吹干，殘渣用流動相200 μL復溶，渦旋振蕩30 s，混勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液80μL進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取空白尿樣、空白尿樣+布洛芬+吲哚美辛（質量濃度均為10 μg/mL）的尿液樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。結果顯示，在“2.1”項色譜條件下，吲哚美辛和布洛芬的保留時間分別為7.02 min和8.13 min，而空白尿液在該保留時間處未見有色譜峰出現，詳見圖1。

2.4.2 標準曲線的繪制及檢測限與定量限的考察 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項下標準工作液各適量，配制成相當于二者質量濃度均為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的混合尿液樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（c）為橫坐標、待測物峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得布洛芬的回歸方程：y布＝56.3c布－9.1（r＝0.999 6，n＝3），吲哚美辛的回歸方程：y吲＝71.9c吲+12.0（r＝0.999 5，n＝3）。結果表明，布洛芬和吲哚美辛的尿藥濃度均在0.1～50.0 μg/mL范圍內線性關系良好。按信噪比（S/N）為3測得兩者的最低檢測限均為0.03 μg/mL，按S/N為10測得兩者的定量下限均為0.1 μg/mL。

2.4.3 精密度與準確度試驗 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項下標準工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質量濃度（均為0.2、10.0和30.00 μg/mL）的混合尿液樣品，各質量濃度平行測定5次，考察其日內精密度；連續測定5 d，考察其日間精密度；將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察準確度。結果顯示，日內、日間RSD均小于10%（n＝5），表明精密度良好；準確度為94.7%～97.2%，表明準確度良好，符合2015年版《中國藥典》（四部）“通則”中生物樣品定量分析方法驗證指導原則對準確度的要求[19]，詳見表1。

表1 精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

表1 精密度與準確度試驗結果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision and accuracy tests（±s，n＝5）

待測物布洛芬吲哚美辛理論質量濃度，μg/mL 0．2 10．0 30．0 0．2 10．0 30．0日內實測質量濃度，μg/mL 0．20±0．02 9．52±1．02 28．41±1．74 0．20±0．02 9．72±1．32 29．13±2．26 RSD，%5．7 5．6 5．2 5．4 6．1 6．3日間實測質量濃度，μg/mL 0．18±0．02 9．35±1．12 28．06±1．81 0．18±0．02 9．37±1．42 29．04±2．47 RSD，%8．5 7．4 7．9 7．9 6．5 7．2準確度，%95．6 95．2 94．7 96．7 97．2 97．1

2.4.4 提取回收率試驗 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項下標準工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質量濃度（均為0.2、10.0、30.0 μg/mL）的混合尿液樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。連續3 d配制上述各質量濃度樣品，每日平行測定5次，將上述樣品的峰面積與未經提取的標準工作液（質量濃度與前者對應）的峰面積進行比較，計算提取回收率。結果顯示，布洛芬、吲哚美辛的平均提取回收率分別為89.5%～91.8%、90.2%～92.4%（RSD均小于10%，n＝15），詳見表2。

表2 提取回收率試驗結果Tab 2 Results of extraction recovery tests

2.4.5 穩定性試驗 取空白尿液100 μL，分別加入“2.2”項下標準工作液各適量，配制成布洛芬和吲哚美辛低、中、高質量濃度（均為0.2、10.0、30.0 μg/mL）的混合尿液樣品各5份。以當日隨行標準曲線計算尿液樣品中2種待測物的質量濃度，分別考察其在室溫、4℃冰箱和－20℃冷凍條件下放置的穩定性。結果顯示，在室溫放置2 d、4℃冰箱放置5 d、－20℃冷凍放置15 d后，上述混合尿液樣品中各待測物的質量濃度均超過理論質量濃度的90%，RSD均小于5%（n＝5），表明穩定性良好，詳見表3。

表3 穩定性試驗結果Tab 3 Results of stability tests

3 討論

布洛芬和吲哚美辛是兩種常見的非甾體抗炎藥，而布洛芬更是世界衛生組織、美國FDA唯一共同推薦的兒童退燒藥，是公認的兒童首選抗炎藥[20]。非甾體抗炎藥是全球使用較多的藥物種類之一，而布洛芬和吲哚美辛又是非甾體抗炎藥中使用最多的藥物。這兩種藥物的同時應用容易加劇共同不良反應的發生（如胃腸道反應加重、肝臟受損等），尤其是在兒童用藥中應時刻保持警惕。因此，監測患者體內布洛芬和吲哚美辛的藥物濃度顯得尤為重要。該類藥物的檢測方法包括HPLC法、LC-MS/MS法、TLC法等，但大部分前處理方法復雜或僅適用于單一藥物的檢測[11-18，21]，而同時檢測這兩種藥物的報道較少。

本研究在已有文獻的基礎上，建立了同時測定人尿液中布洛芬和吲哚美辛濃度的HPLC法。與現有方法相比，該法以尿液作為研究對象，經乙腈沉淀蛋白后，進樣分析，樣品的前處理方法簡單，且用量少。相關文獻報道，布洛芬和吲哚美辛在200～250 nm波長內峰形良好[22]，故本研究比較了200、220、250 nm波長下的檢測效果。結果發現，當檢測波長為200 nm時，待測物的響應信號較弱；當檢測波長為250 nm時，出現了眾多雜質峰，干擾了待測物的測定；而當檢測波長為220 nm時，2個待測物的分離度良好，雜質峰不干擾其測定。因此，最終將檢測波長設定為220 nm。前期試驗中，筆者對流動相的構成進行了考察。結果發現，在流動相中加入乙酸銨可增強待測物的離子化效果，且避免了色譜峰的拖尾現象，提高了靈敏度。同時，還考察了流動相不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5）對檢測的影響。結果發現，當流動相pH為3.5時，布洛芬和吲哚美辛的峰形良好，且受尿液中其他物質的干擾最小，故最終將流動相確定為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（85∶15，V/V，pH＝3.5）。方法學考察結果顯示，在上述色譜條件下，日內、日間RSD＜10%，準確度為94.7%～97.2%，提取回收率為89.5%～92.4%，符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則的要求[19]。

綜上所述，本法以患者的尿液樣品為檢測對象，大大簡化了樣品的前處理過程，縮短了檢測時間，且具有較好的選擇性、精密度和準確度，可用于同時測定人尿液中布洛芬和吲哚美辛的濃度；同時，本法也進一步為布洛芬和吲哚美辛藥物濃度監測和藥動學研究奠定了基礎，也為其他非甾體抗炎藥的分析提供了參考。

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Simultaneous Determination of Ibuprofen and Indomethacin in Human Urine by HPLC

LIU Feng1，ZHOU Hui2，YUAN Taixian3（1.Pharmacy，Xianning Hospital of TCM，Hubei Xianning 437100，China；2.School of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3.School of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University/Key Lab of Clinical Laboratory Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of ibuprofen and indomethacin concentration in human urine.METHODS：The urine samples were precipitated by acetonitrile.HPLC method was adopted.The determination was performed on Discovery C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate solution（85∶15，V/V，pH value adjusted to 3.5 with glacial acetic acid）at the flow rate of 1.0 mL/min.UV detection wavelength was set at 220 nm.The column temperature was room temperature，and sample size was 80 μL.RESULTS：The linear range of ibuprofen and indomethacin were both 0.1-50.0 μg/mL（r＝0.999 6，0.999 5，n＝3）.The limits of quantitation were both 0.1 μg/mL，and the limits of detection were both 0.03 μg/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%（n＝5），and accuracy ranged 94.7%-97.2%.The extraction recoveries of ibuprofen and indomethacin were 89.5%-91.8%and 90.2%-92.4%（all RSDs＜10%，n＝15），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and rapid with high selectivity，sensitivity and accuracy.It is suitable for simultaneous determination of ibuprofen and indomethacin concentration in human urine.

HPLC；Ibuprofen；Indomethacin；Urine concentration

R969.3

A

1001-0408（2017）26-3631-04

2017-03-03

2017-07-09）

（編輯：張元媛）

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.26.09

國家自然科學基金資助項目（No.21672031）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學。電話：0715-8897019。E-mail：liufeng12345000@163.com

#通信作者：高級實驗師。研究方向：生物分析化學。電話：023-68485006。E-mail：514387405@qq.com