高效液相色譜法同時測定獸用復方氨基比林注射液中二組分含量的研究

陳錫龍，孫真崢，王慶紅

(貴州省獸藥飼料監察所，貴陽550003)

高效液相色譜法同時測定獸用復方氨基比林注射液中二組分含量的研究

陳錫龍，孫真崢，王慶紅

(貴州省獸藥飼料監察所，貴陽550003)

建立了獸用復方氨基比林注射液二組分含量測定的高效液相色譜法。以C18柱為固定相，0.05 mol/L的磷酸二氫鉀(用三乙胺調節pH值到8.2)︰乙腈=75︰25為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長240 nm。采用外標法定量計算含量。巴比妥的線性范圍為5.6～280 μg/mL，回歸方程為y=21.856x+42.143(n=5)，相關系數R2=1.0000；氨基比林的線性范圍為14.3～715.0 μg/mL，回歸方程為y=22.267x-13.009 (n=5)，相關系數R2=1.0000。巴比妥80%、100%、120%三個添加水平的回收率在97.86%～101.06%之間，相應的氨基比林的回收率在99.48%～100.84%之間。方法專屬性強，靈敏度佳，準確度高，能夠有效控制獸用復方氨基比林注射液的質量。

復方氨基比林注射液；含量測定；高效液相色譜法

Abstract: A method was developed to determine two components of veterinary Compound Aminophenazone Injection by HPLC, with C18 column as stationary phase, a solution of 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate (pH adjusted to 8.2 by triethylamine)-acetonitrile=75︰25 as mobile phase，flow rate of 1.0 mL/min, column temperature of 30 degree Celsius, and wavelength of 240 nm. It was quantified by external standard method and the linear range of barbital was between 5.6 and 280.0 μg/mL, and the regression equation wasy=21.856x+42.143,R2=1.0000; the linear range of aminophenazone was between 14.3 and 715.0 μg/mL, and the regression equation wasy=22.267x-13.009,R2=1.0000. Results showed that recoveries of 80%, 100%, 120% adding level of barbital were between 97.86% and 101.06%, and relative recoveries of amino￣phenazone were between 99.48% and 100.84%. The method was precise, specific and accurate, and could be used for the content determination of veterinary Compound Aminophenazone Injection.

Keywords: compound aminophenazone injection; content determination; HPLC

獸用復方氨基比林注射液為臨床常用的解熱鎮痛藥，主要用于馬、牛、羊、豬等動物的解熱和抗風濕，也可用于馬和騾的疝痛。復方氨基比林注射液收載于2015版《中華人民共和國獸藥典》[1]，其兩個組分的含量測定均采用滴定法。該方法操作繁瑣，專屬性不強[2]。有文獻[2-4]報道了人用藥品中復方氨基比林注射液或復方氨林巴比妥注射液中三組分的HPLC測定法，但關于獸藥的測定法未見報道。文獻[5-6]只報道了獸藥安痛定注射液中氨基比林和安替比林含量的HPLC法，但不包括巴比妥。本試驗采用普通C18柱作為固定相，通過高效液相色譜法同時測定了復方氨基比林注射液中兩個組分的含量，并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司)；巴比妥對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：171202-201206，含量：99.6%)；氨基比林對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100503-201302，含量：99.9%)；試驗樣品復方氨基比林注射液四批，規格均為10 mL:氨基比林0.715 g+巴比妥0.285 g，編號分別為：A、B、C、D (標稱生產企業名稱及批號分別為：上海申亞動物保健品有限公司，150531；山西易多利動物藥業有限公司，150801；上海申亞動物保健品有限公司，160319；遵義縣獸藥廠，160401)；甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調節pH值到8.2)︰乙腈=75︰25；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm[2-3]；進樣體積為10 μL。在此色譜條件下，復方氨基比林混合標準溶液及供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 復方氨基比林混合標準溶液(a)及供試品溶液(b)色譜圖Fig 1 Chromatograms of standards (a) and sample (b) of compound aminophenazone

1.2.2 標準溶液的制備 分別精密稱取巴比妥對照品28.0 mg和氨基比林對照品71.5 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，混勻，即得巴比妥濃度為280.0 μg/mL，氨基比林濃度為715.0 μg/mL的氨基比林混合標準溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取復方氨基比林注射液1.00 mL，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，混勻，制成巴比妥濃度為285.0 μg/mL，氨基比林濃度為715.0 μg/mL的復方氨基比林溶液作為供試品溶液。

2 結 果

2.1 線性范圍 精密量取巴比妥濃度為280.0 μg/mL、氨基比林濃度為715.0 μg/mL的氨基比林混合標準溶液適量，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含巴比妥濃度分別為5.6、28.0、56.0、140.0、280.0 μg/mL和氨基比林濃度分別為14.3、71.5、143.0、357.5、715.0 μg/mL的混合標準溶液系列。精密吸取各標準溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。巴比妥及氨基比林標準曲線數據分別見表1和表2。

表1 巴比妥溶液的標準曲線數據Tab 1 Data of barbital standard curve

表2 氨基比林溶液的標準曲線數據Tab 2 Data of aminophenazone standard curve

2.2 儀器精密度試驗 精密量取巴比妥濃度為280.0 μg/mL和氨基比林濃度為715.0 μg/mL的混合標準溶液10 μL，上機測定。重復測定6次，巴比妥和氨基比林測量結果峰面積的RSD值分別為0.04%和0.08%，說明方法具有良好的精密度。

2.3 重復性試驗 取批號為160401的D樣品，精密量取適量，分別按標示量用流動相稀釋制成1 mL含巴比妥285.0 μg和氨基比林715.0 μg的供試品溶液，作6個平行，按上述方法中的色譜條件測定，每個平行進樣2針，結果巴比妥和氨基比林的平均含量分別為標示含量的96.0%和95.1%，RSD值分別為0.05%和0.06%。

2.4 回收率試驗 精密稱取巴比妥和氨基比林標準物質適量，按處方分別制成含巴比妥和氨基比林分別為80%(L)、100%(M)、120%(H)的三種不同濃度的添加樣品各3份，然后分別量取100 μL添加樣品置10 mL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度。精密吸取10 μL上機測定，計算各添加樣品的回收率，結果見表3和表4。

2.5 溶液穩定性試驗 取復方氨基比林注射液，精密量取適量，用流動相稀釋制成1 mL含巴比妥285.0 μg和氨基比林715.0 μg的供試品溶液，分別于0、12、24 h，測定峰面積，結果表明溶液在24 h內穩定。

表3 巴比妥回收率試驗結果Tab 3 Recovery results of barbital in different adding level

表4 氨基比林回收率試驗結果Tab 4 Recovery results of aminophenazone in different adding level

2.6 樣品含量的測定 取A、B、C、D四公司生產的復方氨基比林注射液樣品，精密量取1.00 mL置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液，精密吸取10 μL上機測定。另取1 mL含巴比妥280.0 μg和氨基比林715.0 μg的混合標準溶液，作為對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算含量，巴比妥結果分別為96.6%、95.0%、94.9%和95.9%；氨基比林結果分別為101.9%、99.8%、96.1%和95.1%。而傳統的滴定法對應的巴比妥測量結果分別為102.6%、103.2%、99.1%和95.7%；氨基比林結果分別為99.4%、103.2%、100.0%和98.2%。

3 討論與小結

3.1 流動相pH值的選擇 使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈作為流動相時，巴比妥和氨基比林的色譜峰重合在一起無法分離。當用三乙胺調節pH值到8.0以上時，即可把巴比妥和氨基比林的色譜峰分離開。pH越高，得到的峰形越好，不過，普通的C18柱對pH值的耐受有限，一般應低于8.0，最高不能超過8.5。為避免操作不當損壞柱子，故選擇用三乙胺調節pH值為8.2的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈作為流動相。

3.2 流動相比例的選擇 使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調節pH值到8.2)︰乙腈=73︰27、75︰25及 80︰20的比例運行樣品，其中，73︰27的流動相在運行低濃度樣品時，巴比妥的色譜峰會受到試劑峰或雜質峰的干擾； 80︰20的流動相運行樣品時，氨基比林的色譜峰拖尾較嚴重，峰形較差；而 75︰25的流動相峰形良好，保留時間適當，故選擇使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調節pH值到8.2)︰乙腈=75︰25 作為流動相。

3.3 色譜柱的選擇 分別采用粒徑5 μm，4.6 mm×250 mm Waters公司的Symmetry C18，Agilent公司的ZORBAX SB-C18、5TC-C18(2)，Shimadzu 公司的VP-ODS C18以及粒徑3.5 μm，4.6 mm×100 mm的Agilent公司的Eclipse plus C18色譜柱進行試驗。結果表明，普通的C18柱在弱堿性條件下均可分離復方氨基比林注射液中的兩個組分。同時，由于流動相的pH值較高，為避免堿性物質對色譜柱造成損害，宜使用專用的色譜柱。

3.4 滴定法與液相法對檢測結果的影響及原因 復方氨基比林注射液的含量采用傳統的滴定方法進行測定時，所得到的巴比妥的結果略有偏高，這與檢測員判斷滴定是否到達終點有比較密切的關系。當滴定已經到達終點時，滴定經驗不夠豐富的檢測員一般不敢斷定為終點，而是要等到混濁比較明顯時才會終止滴定，而此時終點已過，故滴定結果一般均會略有偏高。同時，樣品中的某些雜質如氯離子等可能也會影響對終點的判定。采用高效液相色譜法進行測量，結果更為準確，因為減少了人為因素帶來的終點誤差。

3.5 試驗方法與文獻報道方法的差異 曾有文獻報道了人用藥品復方氨基比林注射液或復方氨林巴比妥注射液三組份含量測定的高效液相色譜法。但李世彩等[3]所采用的磷酸緩沖液為磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀混合配制而成，未使用三乙胺調節pH值；而楊錫祥等報道的方法[2]中未給出磷酸鹽緩沖液的配制方法，但使用三乙胺調節pH值至8.0，使用的色譜柱長度分別為150 mm和200 mm。許潤娟等[4]使用的流動相為乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉-三乙胺(35︰65︰0.05，用50%醋酸調節pH到8.0)，色譜柱長度為250 mm，流速為0.6 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃。試驗中使用的是常用的250 mm長的色譜柱，并大膽地把pH值提高到8.2，得到的色譜峰峰形也極為理想。其次，流動相比例與文獻報道的也略有差異。雖然240 nm的檢測波長并非氨基比林及巴比妥的最佳檢測波長，但在該波長下巴比妥的色譜峰峰形尖銳，峰寬較窄，不易受到試劑峰的干擾，故也選擇240 nm作為檢測波長。

3.6 小結 采用C18柱作為固定相，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調節pH值到8.2)∶乙腈=75∶25作為流動相，使用高效液相色譜法測定獸用復方氨基比林注射液的含量，方法專屬性強，靈敏度佳，準確度高，能夠有效控制獸用復方氨基比林注射液的質量。

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(編輯：李文平)

SimultaneousDeterminationofTwoComponentsinVeterinaryCompoundAminophenazoneInjectionbyHPLC

CHEN Xi-long, SUN Zhen-zheng, WANG Qing-hong

(GuizhouProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeeds,Guiyang550003,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.10

2017-03-02

A

1002-1280 (2017) 09-0056-06

S859.79

陳錫龍, 高級獸醫師，從事獸藥質量檢驗檢測及相關研究工作。E-mail: cxlofyjs@163.com