Apelin13對人胚胎干細胞定向心肌細胞分化效率的影響

程濤，陳宇，張寧坤，高連如，王澤，張燕

(1安徽醫科大學海軍臨床學院，北京100048；2中國人民解放軍海軍總醫院)

·論著·

Apelin13對人胚胎干細胞定向心肌細胞分化效率的影響

程濤1,2，陳宇1,2，張寧坤2，高連如2，王澤2，張燕2

(1安徽醫科大學海軍臨床學院，北京100048；2中國人民解放軍海軍總醫院)

目的探討Apelin13對人胚胎干細胞(hESCs)定向心肌細胞分化效率的影響。方法將hESCs單層培養后經EDTA消化傳代，應用明確的誘導分化培養基對觀察組(加Apelin13)和對照組(不加Apelin13)定向誘導hESCs向心肌細胞分化。于誘導第2天(中胚層階段)、第4天(心肌分化初始階段)、第7天(心肌分化末階段)作為時間節點，采用實時熒光定量PCR檢測兩組Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA表達水平，采用Western blotting檢測兩組Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ、Nanog、Sox2蛋白表達；同時于誘導第7天采用細胞免疫熒光技術檢測兩組心肌細胞標志物肌鈣蛋白T2(TNNT2)、α-輔肌蛋白(α-actinin)表達。結果誘導第7天觀察組hESCs定向心肌分化程度高于對照組，免疫熒光染色倒置顯微鏡下可清楚看到成熟心肌細胞的肌結及心肌細胞TNNT2、α-actinin表達。在3個誘導時間節點，觀察組Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ mRNA及其蛋白表達均高于對照組(P均<0.05)，觀察組hESCs標志蛋白Nanog、Sox2低于對照組(P均<0.05)。結論Apelin13可提高hESCs向心肌細胞的分化效率。

人胚胎干細胞； Apelin13;心肌細胞； 細胞分化

Abstract:ObjectiveTo explore the effects of Apelin13 on the differentiation of human embryonic stems cells (hESCs) into myocardial cells.MethodsFeeder-free cultured hESCs were passaged into Matrigel-coated plates after being dissociated by EDTA. The cells were cultured in the differentiation medium with 100 nM Apelin13 (experimental group) or without Apelin13 (control group). On day 2, 4, and 7 of induction, real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR)was performed to detect the mRNA levels of the myocardial marker genes, including Brachyury T, Mesp1, Nkx2.5, and APJ. Meanwhile, the protein expression levels of Brachyury T, Mesp1, Nkx2.5, APJ, Nanog, and Sox2 were determined by Western blotting. Furthermore, the expression of TNNT2 and α-actinin at the transcription and protein levels in the differentiated myocardial cells after 7 days of induction was determined by fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence, respectively.ResultsDuring the differentiation process, the introduction of Apelin13 promoted hESC differentiation, most significantly on day 7. Compared with the control group, the qRT-PCR showed that Apelin13 significantly increased the mRNA levels of Brachury T and Mesp1 after 2 days of induced differentiation, and Nkx2.5 and APJ after 7 days of differentiation. Western blotting showed the similar results with increased expression of Brachury T, Mesp1, Nkx2.5, and APJ after differentiation for 2, 4, and 7 days, and significant decrease in the expression of Nanog and Sox2. The differentiated myocardial cells after 7 days of culture also showed obviously positive expression of TNNT2 and α-actinin. Furthermore, the qRT-PCR demonstrated that Apelin13-treated cells showed much higher levels of TNNT2 and α-actinin after 7 days of induced differentiation (all P<0.05).ConclusionApelin13 can improve the differentiation efficiency of hESCs into myocardial cells.

Keywords: human embryonic stem cells; Aplelin13； myocardial cells; cell differentiation

血管緊張素受體(AT1-R)相關受體蛋白(APJ)為7次跨膜G蛋白偶聯受體，其30%的氨基酸序列與AT1-R相同，兩者屬于同源蛋白[1]。Apelin為APJ的內源性配體。Apelin/APJ系統廣泛表達于體內各個系統，共同發揮生物學效應。Apelin基因編碼77個氨基酸前體蛋白原，可被水解酶裂解為大小長度不同的多肽，其中最主要的裂解產物是Apelin13、Apelin36，均為APJ的內源性激動劑。研究發現，Apelin可以對表皮生長因子tdgf-1基因進行調控，從而影響小鼠胚胎干細胞向心臟的定向發育。然而，Apelin/APJ是否對人胚胎干細胞(hESCs)向心肌定向分化的過程產生影響，尚未研究清楚。2016年5月～2017年5月，我們就Apelin13對hESCs定向心肌細胞分化的影響進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 主要材料 E8完全培養基、EDTA人多能干細胞傳代工作液、PBS、Basement Menbrane Matrix、Brachury T抗體、Mesp1抗體、APJ抗體、Nkx2.5抗體、Nanog、Sox2(美國Abcam公司)；肌鈣蛋白T2(TNNT2)抗體、α-輔肌蛋白(α-actinin)、FITC標記的羊抗兔抗體、FITC標記的羊抗鼠抗體(美國Santa Cruz公司)；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；Oligo(dT)、dNTP、RNase Inhibitor(美國Takara公司)；ReverTra Ace、buffer (Toyobo)、SYBR Select Master Mix(美國Life公司)；氯化鈉、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、IPTG、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、三羥基氨基甲烷、甲醇、乙醇、異丙醇、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、吐溫20等購自國藥集團化學試劑北京有限公司。倒置相差顯微鏡(日本NIKON公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)；共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)；電泳儀。

1.2 hESCs培養及傳代 將Matrix按1∶100的比例稀釋成生物活性減量工作液，在6孔板中每孔加入1 mL的Matrix工作液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h。將板置于超凈工作臺，棄上清，每孔加入1 mL的E8完全培養基。將hESCs均勻接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，當細胞匯合度達到80%以上時，進行細胞傳代。用于傳代的細胞培養基棄上清，用無鈣鎂的PBS溶液清洗1次，加入1 mL的EDTA傳代工作液使之完全覆蓋板底，室溫孵育10 min。在顯微鏡下觀察到細胞邊緣卷起，細胞間隙明顯可見，停止消化，棄消化液，加入1 mL的E8完全培養基工作液輕輕吹打培養板，以每孔2×104的細胞密度接種于包被過Matrix工作液的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中傳代培養。

1.3 hESCs向心肌誘導分化 hESCs經EDTA傳代工作液消化，棄上清，PBS洗滌、重懸，調整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔板中。將細胞分為添加100 nmol/L Apelin13的觀察組和未加入Apelin13 的對照組，皆置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞匯合度達到約95%時，棄去E8完全培養基，替換為每孔2 mL的心肌誘導分化培養基CDM3；同時每孔繼續加入2 mL含有6 μmol/L CHIR99021 的CDM3心肌誘導分化培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。之后棄上清，加入含2 μmol/L Wnt C59的CDM3心肌誘導分化培養基，繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。之后將原培養基換成CDM3培養基，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每隔48 h換CDM3培養液1次，直到出現跳動的心肌細胞。

1.4 心肌細胞鑒定 誘導分化第7天，分別取兩組6孔板的1個孔內細胞進行免疫熒光染色。取出6孔板細胞爬片，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，室溫下0.5%的Triten100打孔15 min，加3% BSA封閉30 min，1∶100稀釋的α-actinin和TNNT2抗體4 ℃過夜，PBS洗3次，再加入1∶100倍稀釋的羊抗鼠的二抗，室溫避光孵育1 h，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞熒光染色情況。

1.5 心肌特異性mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法測定。分別收集兩組hESCs誘導前、誘導第2天(中胚層階段)、第4天(心肌分化初始階段)、第7天(心肌分化末階段)細胞，利用TRIzol法提取出細胞的總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。依據Ct值，利用2-ΔΔCt法以GAPDH的量為內參，計算心肌特異性標志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ mRNA表達水平。

1.6 心肌特異性蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測。分別收集兩組hESCs誘導前、誘導第2、4、7天細胞，用PBS漂洗2遍，每孔加入200 μL細胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000 g離心5 min后收集上清，加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴5～10 min。將制備的蛋白樣品進行SDS-PAGE(12%)，電泳后采用濕法轉膜；轉膜后用5%脫脂奶粉(購自BD)室溫封閉2 h，TBST漂洗后加入適度稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。次日去掉一抗，用TBST漂洗3遍，每次10 min，然后加入適度稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h。去掉二抗，用TBST漂洗3遍，每次10 min，最后用ECL進行顯影。檢測心肌特異性特標志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ蛋白及hESCs標志性蛋白Nanog、Sox2的表達。

2 結果

2.1 hESCs培養和傳代 hESCs接種于6孔板5 min后開始貼壁，培養第1天用倒置顯微鏡可以觀察到hESCs體積較小、核大、核仁明顯，形成克隆單位，呈集落生長；第2天細胞排列緊密，集落增大，邊緣光滑；第4天之后各細胞集落出現融合現象。

2.2 hESCs向心肌誘導分化情況 觀察組hESCs在誘導分化的第2天向中胚層階段分化的更多，第7天出現了更加明顯的心肌細胞集落。

2.3 心肌細胞鑒定 誘導分化第7天，免疫熒光染色倒置顯微鏡下觀察組可以清楚的看到成熟心肌細胞的肌結及心肌細胞的標志物TNNT2、α-actinin表達，觀察組TNNT2、α-actinin表達高于對照組。

2.4 不同誘導階段心肌特異性標志mRNA的表達 中胚層的標志物Brachury T mRNA在誘導第2天最高，之后表達迅速下降；心肌分化開始的標志物Mesp1 mRNA在第2天開始上升，第4天表達下降；而Apelin的受體APJ mRNA不受時間限制，是跨越hESCs發育中胚層早、中、晚期及定向心血管分化發育三階段的共同標志物。觀察組Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ mRNA表達均高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 不同誘導階段心肌細胞特異性標志mRNA的表達

2.5 不同誘導階段心肌特異性標志蛋白的表達及hESCs標志性蛋白的變化 在所選的誘導時間節點中，觀察組階段性蛋白標志物Brachury T、Mesp1、Nkx2.5、APJ明顯比對照組高(P均<0.05)。hESCs標志蛋白Nanog、Sox2表達量隨誘導分化時間增加進行降低，觀察組Nanog、Sox2表達量與對照組比較有統計學差異(P均<0.05)。見圖1。

圖1 不同誘導階段心肌細胞特異性標志蛋白及hESCs標志蛋白的表達

3 討論

研究顯示，APJ與心力衰竭、缺血性心臟病、肺動脈高壓型心臟病、高血壓、心肌肥大、心房顫動等心血管疾病密切相關[2, 3]，APJ的增高或降低對心血管疾病的發生與發展有重要影響。但影響APJ增高或降低的機制尚未清楚，因此尋找APJ受體的激動劑或抑制劑尤為重要[4]。因此Apelin作為新發現的APJ激動劑，目前已成為新的醫學研究熱點。本研究采用Apelin13成功誘導了hESCs向心肌細胞分化。細胞形態學觀察顯示，誘導第7天有跳動的心肌細胞出現，細胞呈短柱狀，細胞核位于中部，邊緣清晰，細胞間緊密相聯。Western blotting檢測，hESCs表面蛋白標志物Nanog、Sox2隨著分化進行表達逐漸減少，干細胞的特性逐漸消失；而心肌分化階段性蛋白Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ表達增多。免疫熒光檢測可見心肌細胞的閏盤、肌節結構，成熟心肌細胞標志性蛋白TNNT2、α-actinin表達。誘導第7天觀察組TNNT2、α-actinin表達高于對照組。證明Apelin可以通過增強APJ的效果，提高hESCs向心肌細胞的分化效率[5]。

Apelin在胚胎形成時期對血管的形成至關重要。在青蛙胚胎發育時期中觀察到Apelin/APJ基因共同表達在體節間血管，此區域日后形成脈管系統[6]。在發育生物學的研究中發現，斑馬魚胚胎發育過程中Apelin表達于胚體中線處，它的胚體APJ在邊緣中胚層葉祖細胞中表達。當敲除Apelin基因時，胚胎體節間血管的血液流出口徑變窄，引起胚胎的死亡；當敲除APJ基因時，出現心肌前體細胞缺失，心肌結構無法發育成熟；同時Apelin/APJ信號通路被中斷，原始條紋中的中胚層細胞無法遷移至生心區-前側葉胚區域，嚴重影響心臟發育[7, 8]。這些結果都可以證明Apelin/APJ信號傳導系統影響著心臟祖細胞的遷移、分化，Apelin/APJ的表達是hESCs向心臟方向特定分化的一個重要標志。

胚胎發育過程中，原始心臟祖細胞分化為平滑肌細胞、心肌細胞、內皮細胞等，分化過程經過復雜的信號網絡、轉錄因子等調節，定向分化為心臟和血管。因此定向分化的心臟前體細胞有可能實現真正的心臟再生，同時避免了多潛能干細胞的致瘤性問題；而心臟前體細胞所表達的特異性標志物可以準確判斷hESCs是否向著心血管方向分化。本研究檢測的Nanog基因，最早表達于桑椹胚階段，是hESCs維持自我更新、亞全能性、不分化特征的標志物，同時也是hESCs向各類細胞分化的總開關。隨著hESCs向心肌細胞分化，Nanog表達逐漸減少甚至消失，干細胞的全能性也趨于降低。Sox2蛋白在小鼠的成熟卵母細胞中高表達，卵圓柱期在外胚層和胚外外胚層的位置高表達。在體外，Sox2基因在ESCs中高表達，但隨著ESCs的分化逐漸降低或消失。因此，Nanog和Sox2 是驗證hESCs全能型的特異性標志蛋白[9]。Brachury T、Mesp1、NKx2.5和APJ在誘導前有不同程度的低量表達，誘導開始后表達逐漸增強，誘導1周后，hESCs形態改變，心肌細胞標志性蛋白TNNT2、α-actinin表達顯著增加。有研究發現，Brachury T、Mesp1、NKx2.5和APJ四種基因可以和心肌的肌鈣蛋白、肌球蛋白的啟動子結合，對這些結構基因的表達起啟動或增強作用[10]。本研究在Apelin13促進hESCs定向心肌分化過程中，推測Apelin13可能促進了這四種基因的表達，從而促進肌小節、閏盤的形成，促進心肌細胞的分化成熟。

α-actinin是細胞骨架和細胞內肌絲的組成部分；心肌細胞早期特異性標志物TNNT2參與心肌的收縮和舒張，為心肌晚期特異性標志物。這兩種蛋白高表達，說明了hESCs已分化為成熟的心肌細胞。Brachury T是代表hESCs發育中胚層早期的標志物，Nkx2.5為定向心肌分化的起始標志物，參與心肌前體細胞的形成過程；Mesp1在hESCs遷移至原始胚紋時開始表達，Mesp1陽性的hESCs可以分化出成熟的心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，是中胚層心臟祖細胞的標志[11]。

目前，促進hESCs進行心肌分化的研究方法較多，如二甲基亞砜(DMSO)、5-氮胞苷(5-AZA)、維甲酸(RA)、環孢菌素A(CSA)等都具有一定促進心肌分化的作用，但DMSO、5-AZA具有細胞毒作用，可誘導細胞凋亡；RA和CSA作為抗腫瘤藥物，細胞毒性作用更大[12]。相比之下，Apelin對細胞的毒性作用小，可以提高心肌細胞誘導率，此為干細胞治療心肌梗死等一系列心血管疾病提供了新的思路，也為再生醫學治療壞死的心肌細胞提供了巨大的前景。

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Effects of Apelin13 on efficiency of hESCs differentiating into myocardial cells

CHENGTao1,CHENYu,ZHANGNingkun,GAOLianru,WANGZe,ZHANGYan

(1NavyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100048,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.001

R349.5

A

1002-266X(2017)33-0001-04

國家自然科學基金資助項目(81370238)；北京市自然科學基金資助項目(7142156)。

程濤(1993-)，女，碩士研究生，研究方向為干細胞心肌分化。E-mail:1139353344@qq.com

陳宇(1970-)，女，副主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事干細胞移植的基礎和臨床研究。E-mail:YuChen911@hotmail.com

2017-05-27)