藥物阻斷孵化雞胚禽衣原體垂直傳播作用

朱雅寧石瑜袁雪濤蘇欣

（1，天津市動物疫病預防控制中心 300402；2，天津市靜海區動物疫病預防控制中心 301600）

藥物阻斷孵化雞胚禽衣原體垂直傳播作用

朱雅寧1石瑜1袁雪濤1蘇欣2

（1，天津市動物疫病預防控制中心 300402；2，天津市靜海區動物疫病預防控制中心 301600）

禽衣原體病 （Avian Chlamydiosis,AC）是一種能夠通過接觸在禽類個體中傳播的疾病，甚至可以通過禽類動物傳染給人類，它的發生和鸚鵡熱衣原體直接相關。最初由衣原體導致的發生在人類和鳥身上的疾病被叫做鸚鵡熱，而將非因鸚鵡類禽鳥導致的衣原體疾病叫做鳥疫，事實上這兩種疾病在癥狀方面沒有任何區別。在傳播途徑上，國內外普遍認為鸚鵡熱衣原體的傳播途徑為接觸傳播、空氣氣溶膠傳播和生殖道傳播或人工授精途徑。雖然懷疑有垂直傳播，但一直缺乏足夠證據，最近新發現，鸚鵡熱衣原體傳播3個途徑:種蛋卵黃囊膜垂直傳播、雞弱毒疫苗傳播和SPF雞種蛋傳播。這3種途徑傳播范圍廣，造成的危害更廣。如果能有效阻斷垂直傳播途徑，可以有效減少鸚鵡熱衣原體的傳播和發病，為禽衣原體的防治提供新的技術途徑。

面對家禽衣原體病具有垂直傳播的風險。因此，選擇敏感性高的抗菌素對7～8日齡雞胚進行注射，實施藥物阻斷，從而從傳染源頭上阻斷傳染源，阻斷對商品代家禽的危害。本次選擇天津市某種禽場為藥物阻斷試驗基地，蛋種雞品種為尼克紅，存欄規模為50000套。前期調查發現種禽產蛋高峰期血清抗體陽性率達100%，卵黃膜衣原體檢出率達到65%。衣原體感染已經嚴重危害種禽場的生存問題。

1 材料

1.1 種蛋來源

選擇孵化至7～8日齡的種蛋 （種蛋由天津龍威禽業有限公司提供），首先進行1000枚的小批量阻斷試驗，在此基礎上進行10000枚藥物阻斷試驗，對照組未采用任何藥物處理，處理后觀察其出殼體重、出雛率和卵黃蒂衣原體殘留。

1.2 藥物

鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星原料藥:購自天津恒基利得科技發展有限公司，批次為20130502和20120820。

2 方法

2.1 藥物的配制

2.1.1 鹽酸強力霉素

稱取2mg強力霉素，加入2ml滅菌蒸餾水，配成1mg/ml的原液 (即 1000μg/ml)。

2.1.2 鹽酸環丙沙星

稱取2.5mg，加入2.5ml蒸餾水，配成lmg/ml的原液 (即1000μg/ml)。以上藥物均用0.22μm的針頭濾器過濾除菌，置于-20℃冰箱保存。

2.2 吉姆薩染色方法

2.2.1 固定

無菌取卵黃膜，無菌生理鹽水洗滌卵黃膜，在玻片上展開，后采用甲醇或丙酮固定10～15min。

2.2.2 染色

先用pH為6.8的PBS將吉姆薩母液做10倍稀釋，取稀釋后液體覆蓋細胞標本，置于濕盒中，置于37℃溫箱中孵育30min后用蒸餾水沖洗，自然晾干。

2.2.3 觀察

在顯微鏡下觀察結果，陽性結果表現為:Vero細胞胞質呈天藍色，衣原體包涵體呈紫紅色的均勻顆粒，分布于Vero細胞的細胞質中。

2.3 小批量衣原體阻斷試驗

2.3.1 安全性觀察

接種劑量分別為:鹽酸強力霉素:100.0μg/枚，鹽酸環丙沙星:100.0μg/枚，接種7～8d雞胚的卵黃囊腔，0.2ml胚（50ml卵黃液/枚），石蠟封口，在37～38℃孵育。對照組接種等劑量的滅菌生理鹽水，每組各接種SPF雞胚20枚，每天照蛋，直到雞胚孵化，檢查雞胚的存活特點和雛雞成活特點。排出藥物污染問題和藥物毒性。

2.3.2 小批量阻斷衣原體觀察

燈檢:篩選7～8日齡的污染衣原體的種蛋1300枚，進行燈檢，標識出種蛋的氣室和胚胎所在的位置。

阻斷前種蛋衣原體的檢測:隨機從發育雞胚抽出20枚雞胚，無菌操作，取出卵黃囊膜。在滅菌生理鹽水中進行漂洗3次以上，用眼科鉗取1×1cm大小的膜片，在載玻片上進行黏貼，甲醇固定10min。

吉姆薩染色和測定:先用pH為6.8的PBS將吉姆薩母液做10倍稀釋，取稀釋后液體覆蓋細胞標本，置于濕盒中，置于37℃溫箱中孵育30min后用蒸餾水沖洗，自然晾干。在顯微鏡下觀察結果，陽性結果表現為:卵黃膜細胞呈天藍色，衣原體包涵體呈紫紅色的均勻顆粒，分布于膜細胞的細胞質中。計算種蛋卵黃膜上衣原體包涵體數量 （衣原體形成單位IFU）以及陽性率。

藥物注射:分別以鹽酸強力霉素 （100.0μg/枚）和鹽酸環丙沙星 （100.0μg/枚），接種8日齡。接種后每天進行燈檢（第8～12天），觀察雞胚發育特點和每1000枚種蛋的孵化率以及健康雛雞的數量。

阻斷后衣原體的檢測:取藥物阻斷后6～8d存活的胚胎，無菌取出卵黃組織，在玻片上進行壓片 （1×1cm大小），甲醇固定10min。以稀釋的吉姆薩染色液進行染色，檢查卵黃膜組織的衣原體包涵體。

評價指標:衣原體包涵體單位；出雛率；健康雛雞率和1日齡體重。

2.4 大批量衣原體阻斷試驗

2.4.1 藥物劑量選擇

鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星，注射劑量同上。

2.4.2 設備

采用荷蘭Intervet連續雞胚注射設備，測試連續注射給藥方式。

2.4.3 接種方式

接種前8d照蛋，標記接種位置，0.2 ml/胚，卵黃囊腔接種。石蠟封口，在37～38℃孵育。鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星分別接種10000和12000枚，對照組15000枚，每天照蛋，檢查雞胚的存活特點。

2.4.4 評價指標

出雛率、健康雛雞率和1日齡體重；臍帶吸收特點。

3 結果

3.1 藥物阻斷安全性評價

分別接種鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星后，出雛率分別為90%和95%，對照組為90.0%。健雛率分別為94.4%、94.7%和94.1%，經統計學分析差異不顯著。這提示兩種藥物處理后，對雞胚發育和出殼雛雞的健康無影響。結果見表1所示。

3.2 小批量藥物阻斷前后種蛋衣原體試驗結果

對疑似感染衣原體種蛋卵黃膜進行檢測，處理前高峰期種蛋和高峰后期種蛋衣原體單位 （IFU）分別為158和120，顯示高峰期種蛋衣原體含量比較高。結果見表2所示。

分別接種鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星后，14日齡測定雞胚卵黃囊中衣原體單位分別為0.5和1.1，對照組 （藥物未處理組）為180個衣原體單位。對處理后的雞胚繼續觀察，強力霉素和環丙沙星組出雛率分別為95%和92.4%，顯著高于空白對照組 （86.4%）。此外，出殼后雛雞的平均體重分別為48.7g，49.2g和41.0g，這提示藥物處理后雛雞的生產性能顯著提高，優于對照組。

同時，對出殼后雛雞的卵黃囊殘留進行隨機檢測，強力霉素和環丙沙星衣原體單位分別為0.6和1.8單位，顯著低于空白對照組 （62衣原體單位）。結果見表3、表4和表5所示。

表1 藥物處理后雛雞的生產性能測定

表2 藥物處理前種蛋衣原體平均含量測定

表3 藥物處理后高峰期種蛋衣原體平均含量測定 （14日齡）

3.3 大批量藥物阻斷后雛雞生產性能指標測定

大批量分別接種鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星后，雞胚的出雛率分別為93.6%和95.5%，對照組為82.3%。雛雞出殼體重分別為49.2g，47.8g和42.5g。結果見表6。

此外，持續觀察產蛋高峰期的生產性能，發現鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星組的產蛋率分別為94.5%和92.3%，且產蛋高峰持續維持達到160d之久，對照組平均產蛋性能為77.5%，高峰期上升30d后，產蛋高峰開始下降到70%左右。考察產畸形蛋率指標，鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星組分別為0.24%和0.27%，對照組為0.61%，差異顯著。

表4 藥物處理后雛雞的生產性能測定

表5 小批量藥物處理后雛雞卵黃囊衣原體平均含量測定

表6 藥物批量處理后雛雞的生產性能測定

表7 藥物批量處理后產蛋性能測定結果

再次從平均死亡率和淘汰率指標來看，對照組因為產蛋性能不佳，被迫提前淘汰，達到14.5%，相關強力霉素和環丙沙星處理組淘汰率分別為1.7%和1.5%，顯著性低于對照組。結果見表7所示。

4 分析與討論

4.1 藥物阻斷前后對種蛋衣原體和雛雞攜帶衣原體的影響

禽衣原體能夠寄生在很多動物體內，常見的有鳥類、哺乳動物、人等，并導致一系列的疾病。尤其在鸚鵡和鴿子體內，這種衣原體更為普遍。其傳播途徑主要有飛沫、分泌物、排泄物等。有學者在研究中指出，雞胚感染也是衣原體的傳播途徑之一。

本次試驗顯示，鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星接種處理雞胚后，雞胚卵黃囊中衣原體單位與對照組 （藥物未處理組）呈現顯著性降低。出殼的雛雞出雛率、健雛率和出生體重顯著性高于空白對照組，這提示藥物處理后通過殺死雞胚中的衣原體發育，導致雛雞的生產性能顯著性提高，這說明藥物阻斷衣原體在雞胚中傳播是安全的，而且也是非常有效，適合在基層種禽場進行技術推廣。

4.2 藥物阻斷后對產蛋雞生產性能的影響

將近40%患有輸卵管囊腫疾病的蛋雞體內都發現鸚鵡熱衣原體的存在，揭示出輸卵管積水嚴重程度以及雞產蛋能力受到衣原體的直接影響。家禽免疫系統對這種衣原體具有較高的抗性，很多家禽即便感染了這種病菌，也沒有出現任何疾病癥狀。但若感染衣原體的家禽體內存在家禽感染禽偏肺病毒 （aMPV）、鼻氣管鳥疫桿菌 （ORT）、大腸桿菌 （E.coli）的話，衣原體就會開始威脅到家禽健康，甚至引發嚴重的流行性疾病。衣原體一旦感染蛋雞群，造成30～50%高峰期產蛋雞因為生產性能不良而被被迫淘汰。

通過強力霉素和環丙沙星藥物處理后，高峰期產蛋率均超過90%，且產蛋高峰持續維持達到4個月之久，同時產畸形蛋數量顯著性降低，死淘率也隨著降低，這說明藥物阻斷方法對于家禽衣原體的控制是切實可行的，需要大力進行技術推廣。但如果連續鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星組進行藥物阻斷，衣原體產生的耐藥性以及多重耐藥性可能影響藥物阻斷的效果，今后試驗中需要考慮其風險因素。

5 結論

本次小試和大批量試驗顯示，對種蛋確診感染衣原體的雞胚利用鹽酸強力霉素和鹽酸環丙沙星處理，劑量為100.0μg/枚，對雞胚發育無不良反應。處理后出殼雛雞的成活率、出生體重顯著性升高。同時，高峰期產蛋性能顯著性增加。利用該項技術可以實現阻斷衣原體的垂直傳播。