阿魏酸酯酶在體外模擬豬胃腸道中的穩定性

梅勝, 王鎮發, 羅云, 陳培欽, 李夏蘭

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021；2. 漳州市龍文區環境保護監測站， 福建 漳州 363005)

阿魏酸酯酶在體外模擬豬胃腸道中的穩定性

梅勝1, 王鎮發2, 羅云1, 陳培欽1, 李夏蘭1

(1. 華僑大學 化工學院， 福建 廈門 361021；2. 漳州市龍文區環境保護監測站， 福建 漳州 363005)

模擬了胃(腸)液中pH值、蛋白酶、進食量和微量金屬離子等對阿魏酸酯酶(FAE)酶活穩定性的影響.結果表明：模擬胃液環境對阿魏酸酯酶酶活影響顯著，模擬腸液環境對阿魏酸酯酶穩定性影響較小；蛋白酶酶活的增加不利于阿魏酸酯酶穩定性，但影響不顯著；混合金屬離子對阿魏酸酯酶穩定性影響不顯著；進食量增加可以保護阿魏酸酯酶通過胃液環境，進入小腸發揮作用.在模擬胃液中，阿魏酸酯酶的酶活迅速降低，1 h時，酶活為25%左右，調整為小腸環境時，對阿魏酸酯酶有瞬時激活作用；5 h時，酶活為30%左右；胃腸道pH值是影響阿魏酸酯酶酶活的主要因素，胃蛋白酶、腸道中的金屬離子對阿魏酸酯酶酶活影響較小，進食量對腸道中阿魏酸酯酶有保護作用，模擬腸液對經過模擬胃液處理的阿魏酸酯酶有瞬時激活作用.

阿魏酸酯酶； 飼用酶； 胃腸道； 酶活

Abstract： In this paper, we simulated the influence of pH, protease, food-intake and trace metal ions in the gastrointestinal fluid on the stability of ferulic acid esterase (FAE) activity. The results showed the simulated gastric fluid environment had significant effects on the activity of FAE, whereas the intestinal juice had subtle effects on the stability of FAE. The increasing activity of protease was unfavorable to the stability of FAE, which was not obvious. Similarly, the effect of mixed metal ions on the stability of FAE was not significant. The increasing food-intake could protect FAE from degradation in the gastric environment and make it work in the small intestine. Furthermore, the activity of FAE in the simulated gastric fluid decreased rapidly, which was about 25% of the initial activity in one hour. As for the intestine environment, it had a transient activation to FAE with 30% of the initial activity in five hours. In summary, the pH of the gastrointestinal tract is the key factor that affects the activity of FAE. Both the protease and the metal ions in intestine have a little influence on the activity of FAE. Besides, the food-intake plays a protective role in FAE. And the simulated intes-tinal juice has instant activation on the FAE treated with the simulated gastric juice.

Keywords： ferulic acid esterase; feed enzyme; gastrointestinal tract; enzyme activity

阿魏酸酯酶(EC 1.1.73,feruloyl esterase,FAE)是降解木質纖維的關鍵酶之一.研究表明，單一的FAE作用木質纖維時，效果并不明顯，只有當FAE與其他木質纖維降解酶協同作用，才能顯著提高細胞壁的降解效率[1-3].在飼料工業中，利用阿魏酸酯酶和半纖維素酶處理植物性的原材料，可以水解木質纖維中半纖維素之間，以及半纖維素與木質素之間的阿魏酸酯鍵，釋放阿魏酸和低聚木糖，同時，提高飼料的利用效率[4-6].作為飼用酶制劑不僅要在飼料加工和發酵過程中保持活性，還需經受腸道環境，才能與內源性消化酶共同作用消化食糜，從而降低腸道粘性，降解抗營養因子，促進營養物質的消化吸收[7-8].目前，尚未見FAE在動物胃腸道中的穩定性研究.本文從pH值、金屬離子、蛋白酶和進食量等胃腸道環境對FAE酶活力的影響，探討畜禽消化道對FAE的影響.

1 材料與方法

1.1試驗材料

胃蛋白酶(美國Sigma試劑公司，優級純，貨號為P7000，酶活力為38 841.1 nkat·mg-1)；胰蛋白酶(美國Sigma試劑公司，優級純，貨號為93614，酶活力為166 866.7 nkat·mg-1)；UV-6100型紫外可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；透析袋(MWCO 3500，上海通善生物科技有限公司).

1.2FAE粗酶液的制備

菌種：黑曲霉，實驗室自行篩選并保藏.種子培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，于37 ℃，200 r·min-1下培養2 d.固態發酵培養基：麩皮與次粉(質量比為1∶1)混合物為39.30%， 硫酸鎂為0.06%，硫酸銨為2.44%，水為58.20%.采用白瓷盤固體發酵，33 ℃培養6 d.粗酶液的制備：發酵結束后，在固體發酵料中,加入8倍體積的蒸餾水，于33 ℃，180 r·min-1下抽提2.5 h，用8層紗布過濾，濾液再經超濾濃縮.

1.3FAE酶活的測定方法

FAE酶活的測定方法參照文獻[9-10]建立的分光光度計法.

1.4模擬胃(腸)液的配制

根據美國藥典中模擬胃(腸)液進行配制[11].模擬胃液：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，濃鹽酸7 mL，雙蒸水定容于1 000 mL，pH值約為3.0.模擬腸液：將6.8 g的KH2PO4溶于250 mL雙蒸水，振蕩，完全溶解后加190 mL，0.2 mol·L-1的NaOH和400 mL的雙蒸水；然后,加入胰蛋白酶10.0 g，混勻，用0.2 mol·L-1的NaOH調節pH值到7.0.

2 結果與分析

2.1FAE在模擬胃(腸)液中的穩定性

在豬腸道中影響飼用酶制劑穩定性的主要因素為胃腸的pH值和蛋白酶類.實驗測得酶化發酵飼料中纖維素占干質量的質量分數大于17%.因此，選擇胃中進食時，pH=3.0；空腹時，pH=1.2，排空時間1 h；小腸pH=7.0，排空時間4 h.與FAE最穩定pH值(pH=6.0)中FAE酶活變化做對比，研究FAE在胃腸道中穩定性.

2.2消化時間對FAE穩定性的影響

在裝有5 mL模擬胃(腸)液的透析袋中，加入5 mL FAE濃縮液，調整pH值為3.0(或7.0).然后，將透析袋置于不含蛋白酶的模擬胃(腸)液中，在37 ℃下,保溫4 h，間隔一定時間取樣0.1 mL，迅速滴入0.9 mL，pH值為6.0的檸檬酸緩沖溶液中，于50 ℃水浴鍋中保溫5 min.再次，加入2 mL，50 ℃保溫5 min的200 μmol阿魏酸甲酯(MFA)，于50 ℃反應10 min.最后，加入3 mL體積分數為10%的冰醋酸滅酶，振蕩混勻，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

FAE在模擬胃(腸)液中酶活(Ar)隨時間的變化，如圖1所示.由圖1可知：反應之初，酶活下降迅速；反應1 h后，模擬胃液中的酶活余20%左右；反應4 h時后，FAE幾乎全部失活；而模擬腸液反應4 h后，FAE仍具有70%左右的酶活.由此可知，模擬胃液對FAE酶活影響顯著，模擬腸液對FAE穩定性影響較小.

2.3pH值對FAE穩定性的影響

豬腸胃中的pH值在不同的進食量和進食的不同階段會發生規律性波動.進食時，pH=3.0；從進食到胃排空期間，pH>3；當胃中食糜排空后，pH值降到3以下[12].因為胃的排空時間隨食糜中纖維素和水的質量分數的不同而發生變化[12].配制不加蛋白酶的模擬胃(腸)液，分別用鹽酸或氫氧化鈉調節pH值為1.2，3.0，6.0，7.0，取5 mL于透析袋中，將透析袋置于不含蛋白酶的模擬胃(腸)液中，再加入5 mL FAE濃縮液，于37 ℃下保溫4 h.間隔一定時間取樣，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

不加胃蛋白酶的模擬胃(腸)液時，pH值對FAE穩定性的影響，如圖2所示.由圖2可知：在4 h時，FAE在pH值為6.0，7.0的環境中，能維持80%以上的活性；在pH值為1.2，3.0的環境中，前30 min，酶活分別降到5%，30%，之后下降緩慢；在pH值為1.2的環境中，保持1 h，FAE全部失活；在pH值為3.0的環境中，還有25%的活性.由此可知，小腸的pH值為7.0時，對FAE的穩定性影響較小，而胃的酸性pH值對酶活的影響劇烈.

圖1 消化時間對FAE穩定性的影響 圖2 pH值對FAE穩定性的影響 Fig.1 Effect of digestion time on stability of FAE Fig.2 Effect of pH on stability of FAE

2.4蛋白酶量對FAE穩定性的影響

分別取5 mL含0.5，1.0和2.0倍胃蛋白酶量(或胰蛋白酶量)的模擬胃(腸)液于透析袋中，分別加入5 mL FAE濃縮液，調整pH值為3.0(或7.0).將透析袋置于不含蛋白酶的模擬胃(腸)液中，于37 ℃下保溫4 h.間隔一定時間取樣，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

蛋白酶濃度為模擬胃(腸)液中蛋白濃度的0.5，1.0，2.0倍，FAE的穩定性，如圖3所示.由圖3可知：隨著蛋白酶濃度的增加，FAE酶活的降低速度和殘余酶活力隨胃蛋白酶濃度的增加而緩慢降低.由此可知，胃蛋白酶酶量和胰蛋白酶酶量增加不利于FAE的穩定性.

2.5胃腸中混合金屬離子對FAE穩定性的影響

參照文獻[13]模擬胃腸中的金屬離子濃度.取5 mL含混合金屬離子(2 mmol·L-1的Ca2+，0.01 mmol·L-1的Cu2+，Zn2+，Mn2+，Fe2+)的模擬胃(腸)液于透析袋中，分別加入5 mL FAE濃縮液，調整pH值為3.0(或7.0).將透析袋置于含混合金屬離子，不含蛋白酶的模擬胃(腸)液中，37 ℃下保溫4 h.間隔一定時間取樣，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

楊道秀[14]報導Fe2+，Cu2+，Zn2+，Ca2+，Mn2+等金屬離子對FAE酶活有抑制作用.根據腸胃中存在的金屬離子種類和濃度，檢測模擬胃(腸)液中 Ca2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+和Fe2+對FAE酶活的影響[13]，如圖4所示.由圖4可知：添加了金屬離子的模擬胃(腸)液中FAE的殘余酶活力和無添加金屬離子的胃(腸)液的殘余酶活力相似.這可能是FAE濃縮液中含有其他的蛋白質或酶，減弱了金屬離子對FAE酶活的影響.

圖3 胃蛋白酶和胰蛋白酶對FAE穩定性影響 圖4 金屬離子對FAE穩定性的影響Fig.3 Effect of pepsin and trypsin on Fig.4 Effect of metal ions on stability of FAE stability of FAE

2.6進食量對FAE穩定性的影響

分別將20 g質量比分別為2∶4∶4，4∶3∶3，5.0∶2.5∶2.5，6∶2∶2，8∶1∶1的酶化發酵飼料、模擬胃(腸)液和FAE濃縮液混合物放置于錐形瓶之中，在37 ℃，50 r·min-1下振蕩4 h.間隔一定時間取樣，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

進食量與液體(或腸液)的質量比分別為2∶8，4∶6，5∶5，6∶4，8∶2時，FAE在模擬胃(腸)液中殘余酶活力隨時間的變化，如圖5所示.胃腸中食糜的質量分數對食糜的排空時間、胃腸pH值的下降速率，以及胃液、腸液與食糜中外源性酶的接觸有一定影響.由圖5可知：隨著進食量的增加，在模擬胃環境中反應0，2，4 h后，FAE的相對酶活力也明顯提高;在進食量與胃液的質量比為8∶2時，2 h后,FAE相對酶活力為70%，4 h后,仍有60%左右.由圖5還可知：隨著進食量的增加，在模擬小腸環境中反應0，2，4 h后，FAE的相對酶活力相應地提高，但相對酶活力在70%以上;當進食量與胃液質量比為8∶2時，4 h后，FAE相對酶活力為85%以上.

2.7模擬胃(腸)液連續作用對FAE的影響

取5 mL模擬胃液于透析袋中，加入5 mL FAE濃縮液，調整pH值為3.0，37 ℃下,保溫1 h，然后，將模擬反應液調節pH值至7.0，加入10 mL模擬腸液，37 ℃再保溫4 h.間隔一定時間取樣，參照文獻[9-10]檢測FAE酶活，每次取樣測3次酶活，取平均值，每組重復3次.

胃和腸是串聯系統，部分蛋白酶從胃的酸性環境轉入小腸的中性環境中，酶活有一定的恢復[13].將FAE在模擬胃液中保溫1 h，再加入模擬腸液，保溫4 h，檢測FAE酶活變化，如圖6所示.由圖6可知：在模擬胃液中，FAE的酶活隨時間而減少，在1 h時，酶活為25%左右；加入模擬腸液，并調節pH值至7.0，FAE的酶活有一定恢復；隨著在模擬腸液中的反應，FAE的酶活繼續降低，5 h時，酶活約為30%.

3 討論

孫建義等[13]通過研究在體外模擬動物腸胃條件下β-葡聚糖酶穩定性發現，酶活的降低主要是由低pH值引起的，胃蛋白酶對酶活性無顯著影響，且β-葡聚糖酶在胃內的活性較低，但能在小腸中恢復部分酶活，這與文中的研究結果相似.但孫建義等[13]發現在模擬胃條件下，金屬離子混合液對酶活有促進作用，而在模擬小腸條件下，金屬離子混合液對酶活有抑制作用，這與文中的研究結果有差別.

文中研究表明：隨著進食量的增加，FAE的相對酶活力也相應提高.其原因可能是加大進食量有利于保護FAE通過胃液的酸性環境.此外，腸液中的中性環境，對經過胃液的FAE有短暫的激活作用.與Morgavi等[15]研究發現糖苷酶、纖維素酶和木聚糖酶在胃蛋白酶和酸性(pH=3.0)條件下會部分失活，在胰蛋白酶溶液和中性(pH=7.0)條件下,呈現瞬時增加的現象相吻合.

胃腸道pH值是影響FAE酶活的主要因素，胃蛋白酶、腸道中的金屬離子對FAE酶活影響較小，進食量增加對腸道中FAE有保護作用，模擬腸液對經過模擬胃液處理的FAE有一定激活作用.因此，FAE作為飼用酶制劑在飼料中應用時，一方面，可以考慮加大三元豬的采食量，減少FAE酶活在胃液低pH中的損失；另一方面，將FAE應用于胃酸分泌量不多(pH為4.0左右)的斷奶仔豬的飼喂，推斷FAE在斷奶仔豬腸胃中的酶活穩定性應更好.

[1] BRAGA C M,DELABONA P S,LIMA D J,etal.Addition of feruloyl esterase and xylanase produced on-site improves sugarcane bagasse hydrolysis[J].Bioresource Technology,2014,170(5):316-324.

[2] BARTOLOME B,GOMEZ C C,SANCHO A I,etal.Growth and release of hydroxycinnamic acids from Brewer′s spent grain by streptomyces avermitilis CECT 3339[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,32(1):140-144.

[3] SELIG M J,KNOSHAUG E P,ADNEY W S,etal.Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities[J].Bioresource Technology, 2008,99(11):4997-5005.

[4] 楊道秀,李夏蘭,陳培欽,等.新型復合酶在肉雞飼料中的應用[J].食品與生物技術學報,2013,32(4):410-416.

[5] MATHEW S,ABRAHAM T E.Studies on the production of feruloyl esterase from cereal brans and sugar cane bagasse by microbial fermentation[J].Enzyme and Microbial Technology,2005,36(4):565-570.

[6] 楊紅建,黎大洪,謝春元,等.阿魏酸酯酶處理對草、玉米秸、稻秸及麥秸瘤胃體外發酵特性的影響[J].動物營養學報,2010,22(1):207-211.

[7] 郝志敏.飼用酶制劑的開發應用及存在的問題[J].飼料與畜牧,2010(11):25-27.

[8] 張偉,詹志春.飼用酶制劑研究進展與發展趨勢[J].飼料工業,2011(增刊1):11-19.

[9] YUE Q,YANG H J,LI D H,etal.A comparison of HPLC and spectrophotometrical methods to determine the activity of ferulic acid esterase in commercial enzyme products and rumen contents of steers[J].Anim Feed Sci Tech,2009,153(3/4):169-177.

[10] MATHEW S,ABRAHAM T E.Studies on the production of feruloyl esterase from cereal brans and sugar cane bagasse by microbial fermentation[J].Enzyme Microb Tech,2005,36(4):565-570.

[11] MILLER L C.The United States pharmacopeia[M].Rockville： United States Pharmacopeial Convention, 1983:510-530.

[12] STRUBE M L,MEYER A S,BOYE M.Minireview: Basic physiology and factors influencing exogenous enzymes activity in the porcine gastrointestinal tract[J].Animal Nutrition and Feed Technology,2013(13):441-459.

[13] 孫建義,李衛芬,顧賽紅.體外模擬動物腸胃條件下β-葡聚糖酶穩定性的研究[J].中國畜牧志,2002,38(1):18-19.

[14] 楊道秀.阿魏酸酯酶在麥糟酶化飼料中的應用[D].廈門:華僑大學,2013:20-23.

[15] MORGAVI D P,BEAUCHEMIN K A,NSEREKO V L,etal.Resistance of feed enzymes to proteolytic inactivation by rumen microorganisms and gastrointestinal proteases[J].Journal of Animal Science,2001,79(6):1621-1630.

(責任編輯： 錢筠英文審校： 劉源崗)

StabilityofFerulicAcidEsteraseinSimulatedGastrointestinalTractofPigs

MEI Sheng1, WANG Zhenfa2, LUO Yun1, CHEN Peiqin1, LI Xialan1

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Longwen District Environmental Protection Monitoring Station of Zhangzhou, Zhangzhou 363005, China)

10.11830/ISSN.1000-5013.201608020

2016-08-19

李夏蘭(1965-)，女，教授，博士，主要從事生物化工的研究.E-mail:xialan@hqu.edu.cn.

福建省發改委投資項目(2013-886)

Q 95.33

A

1000-5013(2017)05-0659-05