pDNA-巰基殼聚糖納米粒的制備及Box-Behnken效應面法工藝優化

曾皓月， 王之， 方美娟， 王立強

(1. 華僑大學 生物醫學學院， 福建 泉州 362021；2. 蘭州軍區總醫院 臨床藥學科， 甘肅 蘭州 730000；3. 廈門大學 藥學院， 福建 廈門 361000)

pDNA-巰基殼聚糖納米粒的制備及Box-Behnken效應面法工藝優化

曾皓月1， 王之2， 方美娟3， 王立強1

(1. 華僑大學 生物醫學學院， 福建 泉州 362021；2. 蘭州軍區總醫院 臨床藥學科， 甘肅 蘭州 730000；3. 廈門大學 藥學院， 福建 廈門 361000)

以巰基殼聚糖(TCS)為基因載體，采用離子交聯法制備能用于基因口服研究的質粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs).分別以TCS質量濃度、三聚磷酸鈉(TPP)質量濃度、pH值和轉速為考察對象，以pDNA-TCS-NPs粒徑和Zeta電位為評價指標，采用4因素3水平Box-Behnken 效應面法篩選最佳制備工藝，并對其外觀形態，包封率等體外性質進行考察.結果表明：TCS質量濃度為0.80 mg·mL-1，TPP質量濃度為0.65 mg·mL-1，pH=5.3，轉速為2 000 r·min-1是最優制備工藝，可制得粒徑為(134.21±1.34) nm，Zeta電位為(24.36±0.29) mV，包封率在(80.26±0.56)%，形狀規則且分散良好的pDNA-巰基殼聚糖納米粒；Box-Behnken 實驗設計可用于預測和優化pDNA-TCS-NP制備工藝優化篩選.

巰基殼聚糖； 質粒DNA； 納米粒； Box-Behnken效應面法； 離子交聯法； 工藝優化

Abstract： Preliminary exploration to prepare plasmid DNA-loaded thiolated chitosan nanoparticles (pDNA-TCS-NPs) which can be used for gene oral administration was investigated. Using TCS as gene carriers, the pDNA-TCS-NPs were prepared by the ionic cross-linking method. The effects of the concentrations of TCS and TPP, pH value and stirring speed were investigated on the particle diameter and zeta potential of the pDNA-TCS-NPs. In addition, the formula was optimized by Box-Behnken design and response surface method with four factors and three levels, and the physic-chemical properties such as the shape and encapsulation efficiency were also studied. The results showed that the optimal formula was as follows: TCS concentration 0.80 mg·mL-1, TPP concentration 0.65 mg·mL-1, pH 5.3, and stirring speed 2 000 r·min-1. Particle diameter was (134.21±1.34) nm, zeta potential was (24.36±0.29) mV, and efficiency was (80.26±0.56)%.under the optimal conditions. The pDNA-TCS-NPs showed uniform spherical solid particles with regular shape and ideal uniformly dispersion. It′s also confirmed that the Box-Behnken experimental design and response surface method could be used to predict and optimize the pDNA-loaded TCS nanoparticles.

Keywords： thiolated chitosan； plasmid DNA； nanoparticle； Box-Behnken design and response surface method； ionic cross-linking method； formula optimization

如何用藥學技術手段提高口服基因藥物在體內外的穩定性，從而提高口服基因轉染效率，是當前口服基因治療的首要問題[1-2].通過采用高分子材料制備出直徑1 000 nm以內的納米粒.以此構建出非病毒口服基因藥物遞送系統，因其具有提高基因藥物穩定性，促進生物膜的轉運和吸收，且靶向性、順應性好等諸多優點已成為一大研究熱點[3].與使用其他非病毒納米粒制備的載體相比，以巰基殼聚糖為基礎的口服納米遞送系統，具有以下3個主要特點：1) 巰基殼聚糖中游離的巰基經氧化可形成二硫鍵，其結合力遠強于靜電效應可提高載體的胞外穩定性[4]；2) 巰基殼聚糖上的巰基通過與腸黏膜和腸上皮細胞表面富含半胱氨酸殘基的粘蛋白形成二硫鍵，發揮黏附作用延長所載藥物滯留時間，促進藥物吸收；3) 當其入胞后，在細胞內谷胱甘肽的參與下，破壞其二硫鍵，將基因藥物與載體解離令目的基因得以釋放[5-6].響應曲面法(RSM)是通過對實驗設計的因素進行考察，對其相關關系進行分析，從而確定出最佳實驗方案，并利用計算機技術進行數據分析的優化方法.目前，最常用有星點設計法(CCD)，Box-Behnken Design(BBD)法等[7].本文通過采用 Box-Behnken效應面法，對質粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs)的制備工藝進行優化.

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；集熱式磁力攪拌器(河南省鞏義市華儀儀器有限公司)；臺式高速離心機(美國Thermo公司)；Malvern ZEN-3600型粒徑測試儀(英國馬爾文公司)；LGJ-18S型冷凍干燥機(北京松源華興科技有限公司)；透射電鏡(日本Nikon公司).

巰基殼聚糖(華僑大學實驗室提供)；三聚磷酸鈉(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)；增強型綠色熒光蛋白質粒基因(pDNA，5.3 kb，華僑大學實驗室擴增和提純)；其余常規試劑(上海國藥集團化學試劑有限公司).

1.2pDNA-TCS-NPs的制備

采用離子交聯法制備質粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs).取適量巰基殼聚糖，緩慢加入0.1 mol·L-1的醋酸溶液，在37 ℃下攪拌溶解，并調節其pH值，制備出巰基殼聚糖溶液；然后，向溶液中緩慢加入1 μg的pDNA，另取適量的TPP溶于去離子水中，將TPP溶液以15 滴·min-1的速度緩慢加入到巰基殼聚糖溶液中，攪拌30 min，于超純水中透析36 h(截留相對分子質量為3.5 u)，凍干可得pDNA-TCS-NPs.

1.3pDNA-TCS-NPs體外性質初步評價

1.3.1 形態測定 采用復染法對其形態進行測定，吸取適量濃縮pDNA-TCS-NPs溶液置于銅網中，使用磷鉬酸銨溶液進行負染，待其風干后，采用透射電鏡拍攝納米粒的形態.

1.3.2 粒徑與Zeta電位的測定 使用去離子水對經過透析濃縮的pDNA-TCS-NPs懸液進行稀釋，采用馬爾文粒徑測試儀測量其粒徑(d)和Zeta電位(E).

1.4Box-Behnken效應面法優化

選取對pDNA-TCS-NPs粒徑和電位影響較為顯著的4個因素，即TCS質量濃度(A)，TPP質量濃度(B)，pH值(C)，轉速(D)，在3個水平上進行優化研究.效應面因素水平，如表1所示.

表1 效應面因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface method

2 實驗結果與分析

2.1Box-Behnken效應面法設計結果

2.1.1 擬合方程 以Y1(粒徑，d)和Y2(電位，E)為相應指標，進行29個實驗點的優化實驗，結果如表2所示.

表2 Box-Behnken 實驗設計及響應值Tab.2 Box-Behnken experimental design and response values

利用Design-Expert 8.0軟件，對設計實驗結果(表2)進行分析.以粒徑Y1作為因變量，通過擬合，得出的方程為

以電位Y2作為因變量，通過擬合，得出的方程為

2.1.2 效應面優化與預測 根據擬合方程的相關系數可知，該模型擬合度良好，可以用來作為TCS-NP的分析和預測，結果如表3所示.

表3 檢測回歸方程中系數的顯著性Tab.3 Significance test of coefficient in regressionequation

根據擬合方程(1),(2)，運用Design-Expert 8.0軟件，繪制因素A(ρ(TCS))，B(ρ(TPP))，C(pH)，D(n)對Y1(d)，Y2(E)的響應面圖[7]，如圖1所示.

(a) A-B-Y1 (b) A-B-Y2

(c) A-C-Y1 (d) A-C-Y2

(e) A-D-Y1 (f) A-D-Y2

(g) B-C-Y1 (h) B-C-Y2

(i) B-D-Y1 (j) B-D-Y2

(k) C-D-Y1 (l) C-D-Y2圖1 各因素與響應值的三維圖Fig.1 Three-dimensional plot of independent factors and response values

根據實驗結果選定適當的評價指標范圍，可以得到最優制備工藝，即TCS質量濃度為0.82 mg·mL-1，TPP質量濃度為0.67 mg·mL-1，pH值為5.27，轉速為1 992.23 r·min-1，則由此可預測粒徑為130.215 nm，電位為25 mV.

圖2 pDNA-TCS-NPs納米粒透射電鏡照片Fig.2 SEM photograph of plasmid DNA-loaded thiolated chitosan nanoparticles

2.1.3 優化工藝驗證 為驗證最優制備工藝及模型的準確性，并考慮實際操作的可行性，將各個處方因素進行細微調整，即TCS質量濃度為0.80 mg·mL-1，TPP質量濃度為0.65 mg·mL-1，pH值為5.3，轉速為2 000 r·min-1.按照上述工藝制備出3批pDNA-TCS-NPs，并對其粒徑、電位、包封率進行測試，可得粒徑為(134.21±1.34) nm，電位為(24.36±0.29) mV，包封率為(80.26±0.56)%.通過透射電鏡觀察pDNA-TCS-NPs，發現其外觀為較規則的圓形，如圖2所示.

3 討論

對殼聚糖進行化學修飾，能夠進一步改善殼聚糖基因藥物運輸載體的穩定性、運輸效率及轉染效率等性能.Jiang等[8]通過對聚乙二醇殼聚糖接枝聚乙烯亞胺，制備出可用于肝細胞的基因藥物運輸載體.Kwon等[9]采用葉酸修飾殼聚糖，制備出能夠在葉酸陽性受體細胞表達的基因藥物載體.研究采用經巰基修飾的殼聚糖，制備出可用于口服的納米藥物運輸載體.

在進行多變量多水平的實驗設計時，采用Box-Behnken 效應面法，可以考察各變量間交互作用.該方法與中心復合設計法相比，具有試驗次數少、節約成本的特點，還避免了由于正交設計和均勻設計試驗所引起的無法精確得到最佳點的問題[10].

選擇pDNA-TCS-NPs粒徑和Zeta電位作為評價標準，對其制備工藝進行改善.結果表明：在一定范圍內，pDNA-TCS-NPs粒粒徑大小與巰基殼聚糖質量濃度關系呈正相關，TCS質量濃度高，高分子數目增多，增強了分子間凝聚作用，所以pDNA-TCS-NPs粒粒徑變大.在低質量濃度TCS下，TPP質量濃度變化對粒徑的影響不大；但在高質量濃度下，納米粒粒徑隨著TPP質量濃度呈現出正相關關系.因為在合適的質量濃度下，微粒間的接觸增加利于發生交聯，從而可通過調節TCS與TPP的質量濃度來改變納米粒的粒徑.

TCS納米粒的電位則主要與溶液pH值有關.納米粒電位隨著pH值的降低而增大，pH值較低時，聚合物電離程度高，便于其與TPP反應，形成小粒徑納米粒.文中所制備的納米粒呈較為規則的球形，包封率良好，用于細胞和動物模型均得到理想的實驗預期，保證了體內外的穩定性.說明該納米粒在口服基因領域的獨特優勢，后期可研究其胞內轉運的相關機制.

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(責任編輯： 陳志賢英文審校： 劉源崗)

PreparationofpDNA-LoadedThiolatedChitosanNanoparticlesandOptimizationbyUsingBox-BehnkenDesignandResponseSurfaceMethod

ZENG Haoyue1， WANG Zhi2， FANG Meijuan3， WANG Liqiang1

(1. School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China； 2. Department of Clinical Pharmacy， General Hospital of Lanzhou Military Command， Lanzhou 730000， China；3. School of Pharmaceutical Sciences， Xiamen University， Xianmen 361000， China)

10.11830/ISSN.1000-5013.201703054

2017-03-17

王立強(1970-)，男，教授，博士，主要從事藥劑學和藥物開發的研究.E-mail:wlq1599@163.com.

國家自然科學基金資助項目(81302652)； 福建省自然科學基金資助項目(2015J01342)

R 944

A

1000-5013(2017)05-0676-06