土壤辛硫磷污染對蚯蚓的生態毒理效應研究*

賈 茹 王夢遠 黃 擎

(北京理工大學材料學院，北京 100081)

土壤辛硫磷污染對蚯蚓的生態毒理效應研究*

賈 茹 王夢遠 黃 擎#

(北京理工大學材料學院，北京 100081)

采用經濟合作與發展組織(OECD)標準法配置的人工土壤研究了不同初始質量濃度(25、50、100mg/kg)辛硫磷對蚯蚓的生態毒理效應，測定了不同老化時間(7、14、21、28d)下蚯蚓體內及土壤中辛硫磷含量及各項生態毒理指標。結果表明：28d內辛硫磷在蚯蚓體內及土壤中的含量持續降低；蚯蚓體內蛋白質隨老化時間的延長逐漸降低；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性隨辛硫磷初始濃度增加總體呈先升后降的趨勢，隨老化時間的延長，SOD活性總體降低，而CAT活性先降后升；28d時丙二醛(MDA)含量達到最高，且隨辛硫磷初始濃度增加而總體顯著提高(P<0.05)；土壤酸性磷酸酶(ACP)活性隨辛硫磷初始濃度增加而總體提高，而土壤脲酶(UE)活性隨老化時間的延長總體增加。綜合而言，SOD活性、CAT活性、MDA含量及土壤ACP活性可作為評價辛硫磷生態毒理效應的生物標志物，在有機磷農藥的環境安全性評價過程中應給予考慮。

土壤污染 辛硫磷 蚯蚓 生態毒理效應

Abstract: The subacute toxicity of the phoxim at different concentrations (25，50，100 mg/kg) to earthworm was studied by OECD artificial soil method. The phoxim concentrations in the soil and earthworms and ecotoxicological indexes were measured at the 7th，14th，21stand 28thaging day，respectively. Results were as follows：the phoxim concentrations in earthworms and soil kept decreasing within 28 days. The protein concentrations in earthworms decreased with time prolonged. Superoxide dismutase (SOD)，catalase (CAT) activity in earthworms increased first and then decreased with initial concentrations of phoxim increasing. With the aging time increasing，the former activity kept decreasing，while the later tended to decrease first and then rise again. Malondialdehyde (MDA) concentration in earthworms reached the maximum on the 28thday，which increased significantly with initial phoxim concentration increasing in soil (P<0.05). The activity of alkaline phosphatase (ACP) in soil increased with initial phoxim concentration increasing，while that of urease (UE) rose with aging time. In conclusion，SOD activity，CAT activity，MDA concentration and soil ACP activity could be used as biomarkers for evaluation of ecotoxicological effect of phoxim，which should be considered in the environmental security assessment of organophosphorus pesticide.

Keywords: soil pollution; phoxim; earthworm; ecotoxicological effects

我國是一個農業大國，農藥使用品種多，用量大，其中70%(質量分數，下同)～80%的農藥直接散落到環境中，對土壤、地表水、地下水和農產品造成污染，并進一步通過食物鏈對人類健康造成影響。有機磷農藥因其高效性且在環境中具有較低的持久性而取代有機氯農藥并得到廣泛應用[1-2]。辛硫磷是一種以觸殺、胃毒為主的高效低毒有機磷殺蟲劑，主要是通過抑制神經系統乙酰膽堿酯酶活性，使突觸后膜乙酰膽堿累積導致昆蟲死亡[3]，是農業生產中常用的農藥之一。

蚯蚓是陸地食物鏈底部的一種重要生物，在土壤污染生態毒理測試中可作為敏感生物受試物[4-6]，在正常情況下其體內自由基的產生與消除處于動態平衡，當受到外源物質脅迫時，自由基的產生大于分解而發生累積，此時其體內的抗氧化系統發揮作用維持氧化-抗氧化平衡[7-8]。研究表明，蚯蚓體內抗氧化酶活性可作為研究有機農藥生態風險的生物標志物使用[9-11]，但辛硫磷對蚯蚓體內抗氧化體系的研究還鮮有報道。

本研究通過在人工土壤中施加辛硫磷，分析不同老化時間蚯蚓體內及土壤中辛硫磷含量，蚯蚓體內超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、蛋白質含量、土壤脲酶(UE)活性及酸性磷酸酶(ACP)活性，探討蚯蚓體內及土壤中辛硫磷含量與相應酶活性的劑量效應關系，旨在為有機磷農藥的環境安全性評價以及揭示該類化合物的生物毒性機制提供有效的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

辛硫磷為有效成分40%(質量分數)的乳油。選用赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)，以發酵牛糞作為飼料，于室溫(20～25 ℃)、自然光條件下飼養與繁殖，挑選生殖環明顯且無損傷、體重300～500 mg的健康成熟蚯蚓作為受試生物，實驗前將蚯蚓放在濕潤的濾紙上清腸24 h。

實驗用土壤為依據經濟合作與發展組織(OECD)標準法[12]配置的人工土壤，其成分為10%(質量分數，下同)泥炭蘚、20%高嶺土、69%工業石英砂(粒徑為0.1～0.3 mm)，添加1%的碳酸鈣將pH調整為6.5±0.5，配制完成后風干、研磨并過1 mm篩備用。

1.2 實驗方法

取適當體積的辛硫磷乳油用丙酮溶解定容為辛硫磷母液備用。分為4個處理組，包括辛硫磷初始質量濃度為0 mg/kg的對照組以及辛硫磷初始質量濃度為25、50、100 mg/kg的實驗組，每個處理組將400 g風干土壤置于500 mL燒杯中，定量加入辛硫磷母液，用去離子水調節土壤濕度為25%后平衡5 h。預處理后的蚯蚓沖洗干凈，用濾紙吸干體表水分并稱量，每個處理組加入20條蚯蚓。均設3組平行處理。實驗控制條件為：溫度(20±1) ℃，相對濕度80%，光照條件為光照18 h黑暗6 h循環。分別老化7、14、21、28 d后對全部蚯蚓和土壤進行取樣。所取土壤樣品分為兩部分，一部分風干2 d后研磨并過1 mm篩后進行土壤UE和ACP活性分析，另一部分冷凍干燥后測定辛硫磷含量；新鮮蚯蚓樣品測定SOD活性、CAT活性、MDA含量和蛋白質含量，冷凍干燥后進行辛硫磷含量分析。

1.3 指標分析方法

土壤中(或蚯蚓體內)辛硫磷含量分析采用高效液相色譜法。稱取20 g冷凍干燥的土壤(或5 g蚯蚓)加入25(或5) mL丙酮溶液，振蕩1 min后超聲處理20 min。上清液用分液漏斗過濾，濾液經旋轉蒸發處理后定容至10 mL，取1 mL裝入液相色譜儀專用取樣瓶，進行定量分析。

蚯蚓體內CAT活性、SOD活性、MDA含量、蛋白質含量以及土壤ACP、UE活性分析均采用相應試劑盒進行。CAT活性依據H2O2在240 nm處有特征吸收峰，測定酶促反應前后H2O2含量差值計算得出，即每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解的酶活力，單位U/g。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，在560 nm處比色測定超氧陰離子還原氮藍四唑生成藍色甲臜的含量，即黃嘌呤氧化酶偶連反應體系中抑制率為50%時的酶活力，單位U/g。MDA含量依據其與硫代巴比妥酸縮合生成紅色產物在波長532、600 nm處的吸光度差值進行測定，單位nmol/g。蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定，單位μg/mL。土壤ACP活性依據其在酸性環境中催化磷酸苯二鈉水解，進而在660 nm處測得水解產物(苯酚)的生成量進行表征，即37 ℃下每克土壤24 h釋放的苯酚含量，單位U/g。土壤UE活性利用靛酚藍比色法在578 nm處比色測得，即37 ℃下每克土壤24 h產生的氨氮含量，單位U/g。

1.4 數據處理

測定結果均以平均值±標準偏差表示，采用Origin 9.1和SPSS Statistics 20.0軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 蚯蚓體內與土壤中辛硫磷含量

如圖1所示，相同老化時間下，隨辛硫磷初始濃度的增加，蚯蚓體內辛硫磷顯著增加(P<0.05)，100 mg/kg實驗組蚯蚓體內辛硫磷是25 mg/kg實驗組的2.26～7.05倍。各實驗組蚯蚓體內辛硫磷大體隨老化時間的延長而逐漸降低，28 d比7 d降低了87.7%～94.6%。如圖2所示，相同老化時間下，土壤中辛硫磷隨初始濃度的增加顯著升高(P<0.05)，100 mg/kg實驗組土壤中辛硫磷是25 mg/kg實驗組的2.99～10.34倍。各實驗組土壤中辛硫磷均會隨老化時間延長逐漸下降，28 d比7 d降低了65.9%～90.1%。

2.2 蚯蚓體內生理指標變化

如圖3所示，蚯蚓體內蛋白質隨老化時間的延長逐漸降低，28 d比7 d降低了66.8%～69.3%；蚯蚓體內蛋白質隨辛硫磷初始濃度增加無顯著變化。如圖4所示，7、21、28 d時，蚯蚓體內SOD活性隨辛硫磷初始濃度的增加先升后降，25、50 mg/kg實驗組中蚯蚓體內SOD活性達到最大，分別是對照組的1.11～2.10倍；14 d實驗組SOD活性均顯著低于對照組(P<0.05)。SOD活性隨老化時間的延長有總體降低的趨勢。如圖5所示，7 d時，實驗組蚯蚓體內CAT活性比對照組顯著降低13%～42%(P<0.05)；14、21、28 d時，隨著辛硫磷初始濃度增加，CAT活性總體先升后降，25 mg/kg實驗組最高，是對照組的1.10～2.13倍。CAT活性隨老化時間的延長總體呈先降后升的趨勢，21 d時達到最小值。如圖6所示，蚯蚓體內MDA大體隨老化時間的延長而提高，28 d時達到最高。7、14、21 d時，各實驗組MDA與對照組差異總體不顯著；28 d時，50、100 mg/kg實驗組中蚯蚓體內MDA顯著升高(P<0.05)，分別是對照組的1.53、1.52倍。

注：小寫字母相同表示差異不顯著；不同表示差異顯著。圖2至圖8同。

圖1不同老化時間下的蚯蚓體內辛硫磷
Fig.1 Phoxim concentration in earthworms at different aging time

圖2 不同老化時間下土壤中辛硫磷Fig.2 Phoxim concentration in soil at different aging time

圖3 不同老化時間下蚯蚓體內蛋白質Fig.3 Protein concentration in earthworms at different aging time

圖4 不同老化時間下蚯蚓體內SOD活性Fig.4 SOD activity in earthworms at different aging time

圖5 不同老化時間下蚯蚓體內CAT活性Fig.5 CAT activity in earthworms at different aging time

圖6 不同老化時間下蚯蚓體內MDAFig.6 MDA concentration in earthworms at different aging time

2.3 土壤ACP、UE活性變化

如圖7所示，土壤ACP活性隨辛硫磷初始濃度增加而總體提高。21 d內各實驗組土壤ACP活性均總體顯著高于對照組(P<0.05)，7 d時實驗組是對照組的1.53～5.78倍，14 d時為1.06～2.23倍，21 d時為1.36～1.85倍；28 d時，25、100 mg/kg實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)，分別是對照組的0.88、1.69倍，而50 mg/kg實驗組與對照組無顯著差異。如圖8所示，土壤UE活性隨老化時間的延長總體增加，28 d時是7 d的1.28～3.79倍。7、21 d時100 mg/kg實驗組中土壤UE活性最高；14 d時25 mg/kg實驗組最高；28 d各實驗組土壤UE活性顯著低于對照組(P<0.05)。由此可見，在辛硫磷暴露條件下，土壤ACP活性對辛硫磷濃度較敏感，而土壤UE活性則對老化時間更敏感。

圖7 不同老化時間下土壤ACP活性Fig.7 Soil ACP activity at different aging time

圖8 不同老化時間下土壤UE活性Fig.8 Soil UE activity at different aging time

2.4 討 論

由表1可知，蚯蚓體內辛硫磷含量與CAT活性呈顯著負相關，而SOD活性、蛋白質含量、MDA含量則與辛硫磷含量無顯著相關性。

辛硫磷在老化28 d內對蚯蚓體內抗氧化酶系統產生了影響，對不同酶呈現出不同程度的刺激或抑制作用。當蚯蚓受到辛硫磷脅迫時，體內CAT、SOD活性變化趨勢基本一致，隨著辛硫磷初始濃度的增加總體呈先升后降的趨勢。對于清除活性氧自由基，CAT與SOD有著不同的作用機制，CAT可有效將SOD歧化活性氧自由基的產物H2O2轉化為H2O和O2[13-14]。與對照組比，7 d時，25、50 mg/kg實驗組的SOD活性升高，而CAT活性降低，這可能是因為當蚯蚓受到辛硫磷氧化脅迫時，體內自由基數量增多誘導SOD合成量增加，CAT尚未被誘導同時酶蛋白被破壞或消耗導致CAT活性下降[15]，表明生物體內活性氧的清除SOD發揮作用在前、CAT作用在后。14 d時，各實驗組SOD活性降低、CAT活性總體升高，表明辛硫磷脅迫下蚯蚓體內的活性氧自由基大量積累，使SOD活性受到抑制，而H2O2刺激了CAT合成使實驗組CAT活性升高。21、28 d時，總體上SOD、CAT活性在低濃度實驗組受到刺激，而在高濃度實驗組受到不同程度的抑制，表明在實驗后期，當外源污染物對蚯蚓產生的損傷在一定程度內，體內SOD、CAT等抗氧化酶系統能相互協作保護細胞免受活性氧自由基的損傷。

MDA含量是有機體組織或細胞脂質過氧化的產物，其增加是機體細胞膜損傷的標志。在實驗初期，有機污染物刺激蚯蚓體內抗氧化酶活力增加減輕了活性氧對機體細胞的損傷程度，因而實驗組蚯蚓體內MDA含量與對照組總體無顯著變化；28 d時實驗組MDA含量與對照組差異顯著，隨辛硫磷初始濃度升高與老化時間延長，體內大量自由基的產生超出了機體抗氧化系統的清除能力而積累，細胞膜發生脂質過氧化使蚯蚓體內MDA含量總體顯著增加。由此可見，MDA含量變化可作為反映辛硫磷對蚯蚓毒性效應的指標之一。

表1 蚯蚓生態毒理指標相關系數矩陣1)

注：1)*表示具有顯著相關性。

由表2可知，土壤中辛硫磷含量、土壤UE活性和土壤ACP活性間無顯著相關性。

表2 土壤生態毒理指標相關系數矩陣

3 結 語

有機磷農藥辛硫磷對蚯蚓具有毒性效應，使蚯蚓體內各項生態毒理指標產生變化。短期暴露條件下，SOD比CAT先發揮抗氧化作用，而MDA含量無明顯變化。長期暴露條件下，SOD、CAT活性隨著辛硫磷初始濃度增加總體呈先升后降的趨勢，而MDA含量總體顯著增加。辛硫磷暴露會造成土壤ACP活性增加，而土壤UE活性隨老化時間的延長有增加趨勢。綜合而言，SOD活性、CAT活性、MDA含量與土壤ACP活性隨辛硫磷初始濃度不同均會發生變化，這4種指標可作為評價辛硫磷生態毒理效應的生物標志物，在辛硫磷的使用以及環境安全性評價過程中應給予考慮。

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Ecotoxicologicaleffectofphoximpollutioninsoilonearthworms

JIARu，WANGMengyuan，HUANGQing.

(SchoolofMaterialsScienceandEngineering，BeijingInstituteofTechnology，Beijing100081)

賈 茹，女，1992年生，碩士研究生，研究方向為土壤環境化學。#

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*“十二五”農村領域國家科技計劃課題(No.2013BAD16B01)；北京理工大學基礎研究基金資助項目(No.20141042004)；北京理工大學科技創新計劃項目(No.2015CX02027)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.003

2016-04-29)