HPLC法同時測定五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸的含量Δ

耿婕，那順朝克圖，叢麗華，樊精輝，趙春雨，薛培鳳#（.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特000；.內蒙古宇航人藥業有限責任公司，呼和浩特 057）

HPLC法同時測定五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸的含量Δ

耿婕1＊，那順朝克圖1，叢麗華2，樊精輝2，趙春雨1，薛培鳳1#（1.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特010110；2.內蒙古宇航人藥業有限責任公司，呼和浩特 011517）

目的：建立同時測定五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Thermo scientific ODS-2 Hypersil，流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為237 nm，柱溫為25℃，進樣量為20 μL。結果：甘草苷和甘草酸檢測進樣量線性范圍分別為48～480 μg（r＝0.999 9）、90～900 μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.55、2.10 μg/mL，檢測限分別為0.16、0.62 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.08%～97.58%（RSD＝0.93%，n＝6）、95.86%～99.89%（RSD＝1.67%，n＝6）。結論：該方法簡單準確、重復性好，適用于五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的同時測定。

高效液相色譜法；五味沙棘顆粒；甘草苷；甘草酸；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in Wuwei shaji granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Thermo scientific ODS-2 Hypersil column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5%phosphoric acid（gradient elution）with flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 237 nm，and column temperature was 25 ℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges of liquiritin and glycyrrhizic acid were 48-480 μg（r＝0.999 9）and 90-900 μg（r＝0.999 9），respectively.The limits of quantitation were 0.55，2.10 μg/mL，and the limits of detection were 0.16，0.62 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 95.08%-97.58%（RSD＝0.93%，n＝6）and 95.86%-99.89%（RSD＝1.67%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the content determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in Wuwei shaji granules.

KEYWORDSHPLC；Wuwei shaji granules；Liquiritin；Glycyrrhizic acid；Content determination

五味沙棘顆粒源于蒙醫清肺祛痰之主方五味沙棘散，由五味沙棘散經劑型改變而成，由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、梔子等五味中藥材組成[1-2]，具有清熱祛痰、止咳定喘之功效，常用于肺熱久咳、胸中滿悶、胸脅作痛、慢性支氣管炎見上述證候者。現代藥理研究表明，該制劑可顯著改善慢性支氣管炎模型小鼠的炎性病變，增強小鼠免疫功能[3]，改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺部病變[4]。本課題組在前期研究的基礎上建立了測定五味沙棘顆粒中異鼠李素及梔子苷含量的方法[5-6]，但是目前尚未有測定該制劑中甘草主要成分（甘草苷和甘草酸）的方法。鑒于此，本課題組參考2015年版《中國藥典》（一部）[7]及文獻[8-9]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定該制劑中甘草苷和甘草酸含量的方法，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器以及Empower色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-250DA型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA RV10型旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；AB135-S型及AL204型萬分之一電子分析天平（瑞典Mettler-Toledo公司）；Milli-Q AdvntageA10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

五味沙棘顆粒（內蒙古宇航人藥業有限責任公司，批號：20110102、20110201、20110401、20110701、20130 201、20131101，規格：6 g/袋）；甘草苷對照品（批號：120522，純度：≥98%）、甘草酸對照品（批號：120512，純度：≥98%）均購自成都植標化純生物技術有限公司；乙腈為色譜純，甲醇和磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo scientific ODS-2 Hypersil（250 mm×4.6 mm ，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：237 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取甘草苷和甘草酸對照品適量，精密稱定，加90%甲醇溶液制成每1 mL含甘草苷0.12 mg、甘草酸0.28 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品1.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加90%甲醇溶液100 mL，密塞，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理15 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，分別用90%甲醇溶液洗滌藥渣及濾器3次，每次10 mL，合并濾液及洗液，蒸干，殘渣加90%甲醇溶液使溶解，轉移至25 mL量瓶中，并加90%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備缺甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性與專屬性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以甘草苷峰計為6 400，保留時間為17.9 min；供試品色譜圖在與對照品相應的保留時間處有相同的色譜峰，陰性對照溶液在此處無色譜峰，表明其他成分對測定無干擾，專屬性良好。

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加90%甲醇溶液稀釋成甘草苷和甘草酸質量濃度分別為0.024、0.045 mg/mL的混合對照品溶液，精密吸取上述溶液各2、4、8、12、16、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以甘草苷和甘草酸進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得甘草苷回歸方程為y＝2.0×106x+903.66（r＝0.999 9），甘草酸回歸方程為y＝5.2×105x+1 175.3（r＝0.999 9）。結果表明，甘草苷和甘草酸檢測進樣量線性范圍分別為48～480、90～900μg。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，甘草苷和甘草酸的LOQ分別為0.55、2.10 μg/mL；LOD分別為0.16、0.62 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.39%、0.18%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20110701）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.25%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20110701）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，甘草苷和甘草酸含量的平均值分別為0.244 2、0.409 3 mg/g，RSD分別為1.01%、0.93%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：20110701）適量，共6份，精密稱定，分別加入一定質量的甘草苷和甘草酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取5批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算甘草苷和甘草酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取工藝的確定

3.1.1 提取方法的選擇 本試驗分別考察了超聲提取和回流提取兩種方法，結果超聲和回流兩種提取方法對樣品的提取率差異不大，綜合考慮超聲提取法簡單易行，因此選擇超聲為本試驗的提取方法。

3.1.2 提取溶劑的選擇 本試驗對提取溶劑甲醇和乙醇進行了考察，結果發現兩種溶劑提取甘草苷時提取率無明顯差異，而甲醇提取甘草酸時提取率比乙醇高，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.1.3 提取工藝的確定 本試驗以甲醇濃度（%）、甲醇體積（mL）和提取時間（min）為考察因素，應用L9（34）正交表確定了最優提取方法為90%甲醇溶液100 mL，超聲提取15 min。

3.2 流動相的選擇

本試驗考察了乙腈-水、乙腈-1.0%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液4種不同的流動相，其中甲醇-0.5%磷酸溶液和乙腈-水為流動相時，色譜分離度較差；乙腈-1.0%磷酸溶液為流動相時雜質峰較多；乙腈-0.5%磷酸溶液為流動相時，色譜分離度較好且無雜質峰干擾，故選擇乙腈-0.5%磷酸溶液為本試驗的流動相。

綜上所述，本方法簡單準確、重復性好，適用于五味沙棘顆粒中甘草苷和甘草酸含量的同時測定。

[1]白清云.中國百科全書·蒙醫學[M].上海：上海科技出版社，1992：267.

[2]蘇日娜.五味沙棘散研究進展[J].北方藥學，2012，9（5）：103-104.

[3]包桂蘭，于麗君，翟景波，等.五味沙棘散對慢性支氣管炎模型抗炎和免疫作用的研究[J].中藥藥理與臨床，2012，28（5）：58-59.

[4]布林白拉，斯琴塔娜，奧登塔娜，等.蒙藥沙棘五味散對慢性阻塞性肺病模型的作用[J].亞太傳統醫藥，2016，12（24）：11-12.

[5]耿婕，薛培鳳，趙子龍，等.高效液相色譜法測定五味沙棘顆粒中異鼠李素含量[J].中國藥業，2013，22（21）：27-28.

[6]薛培鳳，朝克圖，耿婕，等.HPLC法測定五味沙棘顆粒中梔子苷的含量[C]//中華中醫藥學會.中華中醫藥學會第七次中藥分析學術交流會會議論文集.北京：中華中醫藥學會，2014：246-249.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京.中國醫藥科技出版社，2015：86、535、616-617.

[8]劉敏，周桂華，盧全德.高效液相色譜法測定五味沙棘散中梔子苷的含量[J].中國醫院藥學雜志，2008，28（20）：1803-1804.

[9]拉喜那木吉拉，巴根那.HPLC測定蒙藥五味沙棘散中梔子苷含量[J].中國現代中藥，2007，9（6）：18-20.

Simultaneous Determination of Liquiritin and GlycyrrhizicAcid in Wuwei Shaji Granules by HPLC

GENG Jie1，Nashunchaoketu1，CONG Lihua2，FAN Jinghui2，ZHAO Chunyu1，XUE Peifeng1（1.School of Pharmacy，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2.Inner Mongolia Yuhangren Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot 011517，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）27-3836-03

2017-01-12

2017-06-23）

（編輯：劉 柳）

國家科技支撐計劃項目（No.2011BAI07B02）；內蒙古自治區“草原英才”項目（No.內組通字〔2014〕27號）

＊碩士。研究方向：中蒙藥藥效物質基礎及質量控制。電話：0471-6653178。E-mail：gebi_888@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中蒙藥藥效物質基礎及質量控制。電話：0471-6653146。E-mail：xpfdc@vip.sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.25