HPLC法同時測定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸的含量Δ

李洋，季方茹，潘洪秀，宗希明，繆月英，楊銘，丁立新（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院/黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯 154007）

HPLC法同時測定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸的含量Δ

李洋＊，季方茹，潘洪秀，宗希明，繆月英，楊銘，丁立新#（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院/黑龍江省生物藥制劑重點實驗室，黑龍江佳木斯 154007）

目的：建立同時測定三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸含量的方法，探討不同比例藥對中二者含量的變化。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent 20RBAX XDB-C18，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為266 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：P-香豆酸、阿魏酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.218 6～21.093 μg/mL（r＝0.999 8）、1.836 0～9.180 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.72%～100.30%（RSD＝0.18%，n＝9）、99.11%～100.45%（RSD＝0.46%，n＝9）。三棱-莪術(shù)藥對4個配伍比例（1∶1、2∶1、1∶2、1∶0，m/m）中，三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時P-香豆酸、阿魏酸含量最高。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸含量的同時測定；該藥對中三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時主要有效成分含量最高。

高效液相色譜法；三棱-莪術(shù)；藥對；P-香豆酸；阿魏酸；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of P-coumaric acid and ferulic acid in the couple of Sparganium stoloni and Curcuma aeruginosa，and to investigate rational proportion of the couple.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent 20RBAX XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 266 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10μL.RESULTS：The linear ranges of P-coumaric acid and ferulic acid were 4.218 6-21.093 μg/mL（r＝0.999 8），1.836 0-9.180 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.72%-100.30%（RSD＝0.18%，n＝9），99.11%-100.45%（RSD＝0.46%，n＝9）.Among 4 compatibility proportions of the couple of S.stoloni and C.aeruginosa（1∶1，2∶1，1∶2，1∶0，m/m），the dissolution rate of P-coumaric acid and ferulic acid were the highest when the ratio of S.stoloni-C.aeruginosa（m/m）was 2∶1.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for content determination of P-coumaric acid and ferulic acid in the couple of S.stoloni and C.aeruginosa.when the proportion of the couple of S.stoloni and C.aeruginosa is 2∶1 and the contents of P-coumaric and ferulic acid are the highest，the contents of main etfective components are the highest.

KEYWORDSHPLC；Sparganium stoloni-Curcuma aeruginosa；Couple；P-coumaric acid；Ferulic acid；Content determination

三棱、莪術(shù)為活血化瘀中藥配伍中最常用的藥對[1-3]。二者配伍最早出自《經(jīng)驗良方》三棱丸，兩藥以等量配伍，氣血兼顧，活血祛瘀、行氣止痛、化積消癥之力增強(qiáng)[4-7]；現(xiàn)兩味藥材常用配伍比例（m/m）為1∶1～4∶1[8]。目前兩味藥材作為單味藥進(jìn)行化學(xué)成分研究和藥理毒理研究較多[9-10]，而不同配伍比例后的物質(zhì)基礎(chǔ)研究則相對薄弱，尤其是建立藥對的質(zhì)量控制方法方面[11-12]。2015年版《中國藥典》（一部）未見三棱含量的測定[13]，根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，三棱中P-香豆酸、阿魏酸為其主要活性成分[14-15]；同時，也未見不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對含量測定的報道。為此，本試驗建立了采用高效液相色譜法（HPLC）測定三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸的含量，通過優(yōu)化色譜條件和樣品處理的方法，快速、準(zhǔn)確地測定不同配伍比例三棱-莪術(shù)藥對中P-香豆酸、阿魏酸的含量變化，為三棱-莪術(shù)藥對質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1311A四元泵、G1379A真空再線脫氣機(jī)、G1315DAD檢測器、G1316A柱溫箱（美國Agilent公司）；FW177型中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

P-香豆酸對照品（批號：50198436，純度：＞99.8%）、阿魏酸對照品（批號：07739910，純度：＞99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

莪術(shù)、三棱藥材購于佳木斯市金天藥店，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實驗中心宗希明高級實驗師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：Agilent 20RBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A；5～15 min，20%A；15～35 min，100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：266 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以P-香豆酸、阿魏酸峰計均＞3 000；對稱因子均在0.95～1.05之間；各成分基線分離良好，分離度均＞1.5，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取待測成分適量，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成P-香豆酸、阿魏酸質(zhì)量濃度分別為0.703 1、0.306 0 g/L的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 按三棱-莪術(shù)比例（m/m）為1∶1、2∶1、1∶2、1∶0分別取莪術(shù)、三棱共200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加8倍量60%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濾過，濃縮，冷凍，干燥得提取物粉末；取粉末適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得P-香豆酸、阿魏酸回歸方程分別為y＝1 764.2x+231.65（r＝0.999 8）、y＝416.43x+86.53（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，P-香豆酸、阿魏酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為4.218 6～21.093、1.836 0～9.180 μg/mL。

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD均為1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下混合供試品溶液[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.0%、1.3%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，P-香豆酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.21%、0.26%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量樣品[三棱-莪術(shù)（2∶1，m/m）]適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

取藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝6，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝6，mg/g）

由表2可知，三棱中的主要成分并未隨三棱藥材量的增加而增加；當(dāng)三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時，P-香豆酸和阿魏酸的含量最高。

3 討論

預(yù)試驗中，筆者比較了超聲和回流提取方法制備供試品溶液的差別，結(jié)果顯示回流提取結(jié)果優(yōu)于超聲提取結(jié)果，故采用回流提取方法。筆者分別采用了甲醇-水、乙腈-水作為流動相，結(jié)果顯示甲醇-水作為流動相時出峰較慢且分離度不理想，乙腈-水作為流動相雖然能全部分離，但是組分峰有拖尾現(xiàn)象，故分別在水相中加入甲酸、磷酸、冰醋酸作為改性劑，通過比較發(fā)現(xiàn)加入冰醋酸后峰形較好；并進(jìn)一步考查冰醋酸的用量，結(jié)果顯示乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動相，組分完全分離，且峰形好，出峰快。由于中藥藥對成分復(fù)雜，因此試驗采用梯度洗脫。

本研究藥對不同配伍比例中的含量變化結(jié)果表明，三棱中主要成分并未隨三棱藥材量的增加而增加，同時與傳統(tǒng)方劑三棱丸中三棱-莪術(shù)比例（m/m）為1∶1比較，三棱-莪術(shù)比例（m/m）為2∶1時，P-香豆酸和阿魏酸的綜合含量最高。但三棱、莪術(shù)不同配伍比例時其他成分含量的考察及藥效學(xué)研究有待進(jìn)一步探討。

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Simultaneous Determination of P-coumaric Acid and Ferulic Acid in Different Compatibility Proportions of the Couple of Sparganium stoloni and Curcuma aeruginosa by HPLC

LI Yang，JI Fangru，PAN Hongxiu，ZONG Ximing，MIAO Yueying，YANG Ming，DING Lixin（Pharmaceutical School of Jiamusi University/Heilongjiang Province Key Lab of Biological Medicine Preparation，Heilongjiang Jiamusi 154007，China）

R927

A

1001-0408（2017）27-3859-03

2016-10-05

2016-12-01）

（編輯：張 靜）

佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)研究類項目（No.JMSUJCMS2016-035）

＊碩士研究生。研究方向：中藥分析。電話：0454-8610758

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：天然產(chǎn)物分離、分析。E-mail：DLX200475@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.32