RP-HPLC法同時測定加味補陽還五湯劑中4種成分的含量Δ

王忠成，顧爾莉，王身艷，王芳芳，俞沖，朱敏（.南通市第三人民醫院，江蘇南通6000；.南京中醫藥大學藥學院，南京 003）

RP-HPLC法同時測定加味補陽還五湯劑中4種成分的含量Δ

王忠成1＊，顧爾莉1#，王身艷2，王芳芳1，俞沖1，朱敏1（1.南通市第三人民醫院，江蘇南通226000；2.南京中醫藥大學藥學院，南京 210023）

目的：建立同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為YMC C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為320 nm（阿魏酸）、230 nm（芍藥苷）、207 nm（苦杏仁苷）、280 nm（川芎嗪），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結果：芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸和川芎嗪檢測質量濃度線性范圍分別為 0.191 2～1.912 μg/mL（r＝0.999 6）、0.117 4～1.174 μg/mL（r＝0.999 6）、0.011 5～0.115 μg/mL（r＝0.999 8）和0.001 66～0.016 6 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為1.912、1.174、0.115、0.016 6 μg/mL ，檢測限分別為0.25、0.40、0.05、0.008 5 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.9%～100.3%（RSD＝1.3%，n＝6）、95.1%～100.3%（RSD＝2.2%，n＝6）、95.3%～100.2%（RSD＝2.0%，n＝6）、97.0%～100.0%（RSD＝1.3%，n＝6）。結論：該方法可靠、簡便、準確，適用于同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪的含量。

反相高效液相色譜法；加味補陽還五湯；芍藥苷；苦杏仁苷；阿魏酸；川芎嗪；含量測定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine in Modified buying huanwu decoction.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on YMC C18column with the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 320 nm（ferulic acid），230 nm（paeoniflorin），207 nm（amygdalin），280 nm（ligustrazine）.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine were 0.191 2-1.912 μg/mL（r＝0.999 6），0.117 4-1.174 μg/mL（r＝0.999 6），0.011 5-0.115 μg/mL（r＝0.999 8）and 0.001 66-0.016 6 μg/mL（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 1.912，1.174，0.115，0.016 6 μg/mL，and the limits of detection were 0.25，0.40，0.05，0.008 5 μg/mL，respectively.RSDs of precision，stability and reproducible tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 96.9%-100.3%（RSD＝1.3%，n＝6），95.1%-100.3%（RSD＝2.2%，n＝6），95.3%-100.2%（RSD＝2.0%，n＝6）and 97.0%-100.0%（RSD＝1.3%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is reliable，simple and accurate，and is suitable for simultaneous determination of paeoniflorin，amygdalin，ferulic acid and ligustrazine in Modified buyang huanwu decoction.

KEYWORDSRP-HPLC；Modified buyang huanwu decoction；Paeoniflorin；Amygdalin；Ferulic acid；Ligustrazine；Content determination

補陽還五湯劑出自清代王清任著《醫林改錯》，全方由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花等七味中藥組成，是目前治療中風等血栓性疾病應用頻率最高的方劑，方中重用黃芪補氣，與活血化瘀藥配伍，功在補氣、活血、通絡，主治氣虛血瘀之中風[1]。現代藥理學研究表明，補陽還五湯劑能抑制血小板活化、降低血液黏度，具有抗血栓，抗腦缺血及再灌注損傷，改善血液流變學等作用[1-5]。近年來，國內對補陽還五湯劑的藥效物質基礎及拆方進行了深入研究[6-10]，但是現有研究多以補陽還五湯劑經典方組成及藥物劑量作為研究出發點，方中黃芪使用劑量較大，筆者在臨床應用過程中觀察到，方中君藥黃芪的用量需適宜，若連續超劑量使用，則可因患者病后無力運化而導致氣機壅滯，輕者影響食欲，重者痰濁壅滯。因此，本課題組在上述經典方的基礎上加以化裁，減少黃芪用量，同時加用炒白術、仙鶴草等健脾補氣、消積中藥以擬定加味補陽還五湯劑，并參考相關文獻[11-12]，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸和川芎嗪含量的方法，以期為該方劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695型HPLC儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；FA1004型電子分析天平（寧波舜宇儀器有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海研承儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試劑

芍藥苷對照品（批號：S-061-150921）、苦杏仁苷對照品（批號：K-008-150518）、阿魏酸對照品（批號：A-100-151209）、川芎嗪對照品（批號：C-075-150629）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈和磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

藥材均購自南京益豐大藥房，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定，黃芪為豆科黃芪屬蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus的干燥根；當歸為傘形科當歸Angelica sinensis的干燥根；赤芍為毛茛科芍藥Paeonia lactiflora的干燥根；地龍為鉅引科參環毛蚓Pheretima aspergillum的干燥體；川芎為傘形科川芎Ligusticum chuanxiong的干燥根莖；桃仁為薔薇科桃Prunus persica的干燥成熟種子；紅花為菊科紅花Carthamus tinctorius的干燥花；仙鶴草為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa的干燥地上部分；白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephala的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，8.0%→9.5%A；20～30 min，9.5%→10.0%A；30～35 min，10.0%→15.0%A；35～40 min，15.0%→16.0%A；40～60 min，16.0%→18.0%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm（阿魏酸）、230 nm（芍藥苷）、207 nm（苦杏仁苷）、280 nm（川芎嗪）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 樣品及溶液的制備

2.2.1 樣品的制備 按加味補陽還五湯劑的處方比例取黃芪30 g、當歸30 g、赤芍15 g、地龍10 g、川芎9 g、紅花30 g、桃仁10 g、仙鶴草15 g、炒白術15 g，置于同一2 000 mL圓底燒瓶中，加入相當于上述藥材8倍體積的水，浸泡30 min，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，紗布過濾，濃縮至100 mL，加無水乙醇至含醇體積分數達85%，靜置24 h，抽濾，濾液回收乙醇至無醇味，加水定容至200 mL，即得。共制備3批樣品，編號為1、2、3。

2.2.2 混合對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品19.12 mg、苦杏仁苷對照品11.74 mg、阿魏酸對照品1.15 mg、川芎嗪對照品0.166 mg，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。精密吸取上述各單一對照品貯備液10 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取“2.2.1”項下樣品5 mL，加水定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液 按加味補陽還五湯劑的制備工藝和處方比例，取除赤芍、桃仁、當歸、川芎以外的藥材適量，按“2.2.1”項下方法制備陰性樣品，再按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以苦杏仁苷峰計為5 000，保留時間為24.17 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液40、120、200、280、400 μL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，即得系列混合對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結果見表2。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.4%、0.6%、1.2%、1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液（編號：1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.4%、0.5%、1.0%、1.6%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（編號：1）適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪峰面積的RSD分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.3%（n＝6），表明本方法重復性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear range

表2LOQ與LOD測定結果（μg/mL）Tab 2 Results of LOQ and LOD（μg/mL）

2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（編號：1）0.5 mL，共6份，分別精密加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計樣品含量，結果見表4。

3 討論

表4 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3.1 色譜柱的考察

本試驗曾考察了Chromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、BenetnachTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）以及YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等為本試驗色譜柱時樣品的分離效果。結果表明，YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為本試驗的色譜柱時樣品的分離度及峰形較好，因此選擇上述色譜柱進行試驗。

3.2 流動相的考察

本試驗還考察了不同體積分數的甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-冰乙酸、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-冰乙酸溶液作為流動相的結果。結果，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各待測成分的分離度均較好，因此選擇上述溶液為本試驗流動相。

3.3 檢測波長的選擇

加味補陽還五湯劑含有多味中藥，成分復雜，本試驗對4種待測成分的單一對照品貯備液進行了200～400 nm全波長掃描，在保證各成分含量測定準確的前提條件下，選擇了最大吸收波長作為檢測波長，即阿魏酸在320 nm波長處、芍藥苷在230 nm波長、苦杏仁苷在207 nm波長處、川芎嗪在280 nm波長處，對處方中的樣品含量進行測定。

綜上所述，本方法可靠、簡便、準確，適用于同時測定加味補陽還五湯劑中芍藥苷、苦杏仁苷、阿魏酸、川芎嗪的含量。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Modified Buyang Huanwu Decoction by RP-HPLC

WANG Zhongcheng1，GU Erli1，WANG Shenyan2，WANG Fangfang1，YU Chong1，ZHU Min1（1.Nantong Third People’s Hospital，Jiangsu Nantong 226000，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）27-3849-04

2016-10-28

2017-03-28）

（編輯：劉 柳）

江蘇省中醫藥局科技項目（No.LZ13167）；南通市科技計劃項目（No.HS2013047）

＊主治醫師，碩士。研究方向：中醫藥基礎及臨床。E-mail：doctorwzc@126.com

#通信作者：主任醫師。研究方向：中醫藥臨床。E-mail：740336946@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.29