氫溴酸樟柳堿對急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細胞凋亡及ERK1/2磷酸化水平的影響Δ

陳丹丹，謝曉芳，萬峰，劉莟，趙石，陳秋伶，陳延清，彭成#（.成都中醫藥大學藥學院，成都637；2.雅安職業技術學院藥學檢驗系，四川雅安 625000；3.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 637；.成都第一制藥有限公司，成都 6003）

氫溴酸樟柳堿對急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細胞凋亡及ERK1/2磷酸化水平的影響Δ

陳丹丹1，2＊，謝曉芳1，3，萬峰4，劉莟1，趙石1，陳秋伶1，陳延清4，彭成1，3#（1.成都中醫藥大學藥學院，成都611137；2.雅安職業技術學院藥學檢驗系，四川雅安 625000；3.中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137；4.成都第一制藥有限公司，成都 610031）

目的：研究氫溴酸樟柳堿對急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細胞凋亡及細胞外信號調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）磷酸化（p-ERK1/2）水平的影響。方法：將大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組（尼莫地平1.0 mg/kg）和氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量組（1.2、0.6、0.3、0.15 mg/kg），每組8只，采用線栓法建立大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型。分別于腦缺血2 h和再灌注6 h時對各組大鼠尾iv給藥1次，再灌注22 h后檢測各組大鼠腦組織三磷酸腺苷（ATP）酶活性、Ca2+含量、細胞凋亡情況、腦組織中p-ERK1/2蛋白表達和p-ERK1/2/總ERK1/2（t-ERK1/2）比例。結果：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織ATP酶活性明顯降低、Ca2+含量明顯增加、凋亡細胞密度明顯增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織凋亡細胞密度均明顯減小，陽性對照組和氫溴酸樟柳堿高、低劑量組大鼠腦組織Ca2+含量均明顯降低，氫溴酸樟柳堿高、低、極低劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例均明顯增加，以上差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：氫溴酸樟柳堿能抑制急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細胞凋亡，其作用機制可能與激活ERK1/2信號通路和調節ATP酶活性，進而降低腦組織Ca2+含量有關。

氫溴酸樟柳堿；急性腦缺血再灌注；大鼠；細胞凋亡；細胞外信號調節蛋白激酶1/2

缺血性腦卒中占腦卒中發生率的80%以上，是腦卒中死亡的主要原因[1-2]。因其發病機制復雜，目前臨床上仍缺乏有效的防治措施。病理生理學研究發現，缺血性腦卒中造成患者腦組織損傷的機制主要為腦缺血再灌注損傷（CI/R）。因此需要積極研究對CI/R有確切治療作用的藥物，明確其作用機制。已有研究表明，樟柳堿能降低急性CI/R模型大鼠腦內異常升高的鈣離子（Ca2+）含量和伊文思藍含量，減少腦組織水腫[3]。但對其作用機制缺乏進一步的后續研究，阻礙了該品種的開發和推廣應用。

本研究擬采用線栓法建立大鼠急性CI/R模型，尾iv給予氫溴酸樟柳堿進行干預，從腦組織中三磷酸腺苷（Triphosadenine，ATP）酶活性、Ca2+含量、神經細胞凋亡情況及細胞外信號調節蛋白激酶1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平等方面進一步研究氫溴酸樟柳堿對CI/R大鼠的保護作用及機制，為該藥的開發及臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Enspire多標記微孔板檢測儀（珀金埃爾默新加坡有限公司）；TDZ4A-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；BA200Digital數碼三目攝像顯微鏡（廈門麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氫溴酸樟柳堿原料藥（成都第一藥業有限公司，批號：140903，純度：99%）；尼莫地平注射液（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：BXGVZ71，規格：50 mL∶10 mg）；ATP酶測試盒（包括Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase）、Ca2+含量測試盒、蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160402、20160405、20160407）；原位末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士羅氏公司，批號：10279600）；兔源p-ERK1/2、總ERK1/2（t-ERK1/2）抗體（英國Abcam公司，批號：GR210921-2、GR197011-16）；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：14MA18）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：109525）。1.3 動物

SD大鼠，SPF級，♂，體質量為280～320 g，購自四川省中醫藥科學院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（川）2013-19。本研究嚴格按照《實驗動物護理和使用指南》進行操作，實驗過程符合實驗動物倫理相關要求。

2 方法

2.1 急性CI/R模型的建立

[4]方法并加以改良：術前大鼠禁食12 h，自由飲水，ip給予10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，分離頸總動脈（CCA），結扎CCA近心端，分離頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），結扎ECA、CCA處切口，在近心端距分叉處4 mm切口插入直徑為0.285 mm、頭端打磨光滑的魚線，使其垂直進入ICA，插入長度約為20 mm，以完全阻斷大腦中動脈（MCA）的供血。缺血2 h時輕柔回抽魚線約10 mm，再灌注22 h。假手術組大鼠除不插入魚線外，其余操作同模型組。

2.2 分組與給藥

按照Longa EZ等[4]建立的五分制評分標準于缺血2 h后對大鼠進行評分：0分為無明顯神經損傷癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發行走、意識喪失。選取評分為1～3分的大鼠進入后續實驗，隨機將其分為模型組、陽性對照組（尼莫地平1.0 mg/kg）和氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量組（1.2、0.6、0.3、0.15 mg/kg），每組8只；另設8只大鼠為假手術組。尼莫地平和氫溴酸樟柳堿的給藥劑量是在文獻[3，5]的基礎上結合藥物的臨床給藥劑量設計而成；氫溴酸樟柳堿原料藥使用前用超純水充分溶解并過0.22 μm微孔濾膜后備用。分別于大鼠腦缺血2 h和再灌注6 h時尾iv給予各組大鼠相應藥物1次，共計給藥2次；模型組和假手術組大鼠尾iv給予超純水。

2.3 腦組織中ATP酶活性、Ca2+含量的測定

各組大鼠再灌注22 h后，麻醉，斷頭處死，取缺血側視交叉前冠狀切片腦組織約100 mg，按1∶9（m/V）加入冰冷生理鹽水，制成10%的腦組織勻漿，3 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心15 min，取上清液，按測試盒說明書操作測定ATP酶活性和Ca2+含量。

2.4 腦組織細胞凋亡的測定

各組大鼠斷頭處死后，迅速選取缺血側視交叉附近約1 mm厚度的冠狀切片腦組織，10%甲醛溶液固定。每組隨機選取4只采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，每張切片選取3個典型區域采用BA200Digital數碼三目攝像顯微鏡于400倍鏡下進行圖像采集，計數凋亡細胞，取3個視野的平均值作為該樣本的凋亡細胞密度。

2.5 免疫組化法檢測大鼠腦組織中p-ERK1/2蛋白表達

每組隨機選取6只大鼠，取固定的腦組織脫水、包埋、切片，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，在3%甲醇雙氧水中室溫下放置10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，滴加山羊血清封閉液，室溫放置20 min，加入一抗兔源p-ERK1/2抗體，4℃下過夜；PBS漂洗，滴加HRP標記山羊抗兔IgG，37℃下放置30 min；PBS漂洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性細胞呈棕黃色。于大鼠腦組織陽性細胞分布區隨機選擇3個不重復的200倍視野，采用Image Pro Plus 6.0成像分析系統分析計算其灰度值，每一樣本取3個視野計算平均值。其灰度值與p-ERK1/2蛋白表達呈正相關。

2.6 Western blot法檢測腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例

每組隨機選取3只大鼠，取缺血側半暗帶附近固定解剖部位腦組織約50 mg，按1∶10（m/V）加入蛋白裂解液，提取腦組織蛋白，測定蛋白含量并定量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育后加入兔源p-ERK1/2、t-ERK1/2、GAPDH抗體，4℃封閉過夜，TBST緩沖液洗膜；然后將PVDF膜放入HRP標記山羊抗兔IgG中，37℃孵育1 h；TBST緩沖液洗膜，加入增強化學發光（ECL）顯影液，通過化學發光成像系統對蛋白條帶成像。應用Image-lab圖像處理軟件，以目標蛋白與內參GAPDH灰度值的比值評定目標蛋白的表達水平，并計算p-ERK1/2/t-ERK1/2比例。

2.7 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，正態計量指標采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中3種ATP酶活性均降低、Ca2+含量增加（P＜0.01）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組大鼠均能在一定程度上提高3種ATP酶活性，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；氫溴酸樟柳堿高、低劑量組和陽性對照組大鼠腦組織中Ca2+含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測定結果見表1。

表1 各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測定結果（±s，n＝8）Tab 1 Determination results of ATP enzyme activity and Ca2+content in brain tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表1 各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測定結果（±s，n＝8）Tab 1 Determination results of ATP enzyme activity and Ca2+content in brain tissue of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

Ca2+，mmol/g prot 0.028 0±0.002 8 0.047 4±0.011 7＊＊0.034 3±0.015 4#0.029 5±0.016 4##0.038 1±0.009 6 0.035 2±0.014 6#0.035 6±0.011 4組別假手術組模型組陽性對照組氫溴酸樟柳堿高劑量組氫溴酸樟柳堿中劑量組氫溴酸樟柳堿低劑量組氫溴酸樟柳堿極低劑量組ATP酶，μmolPi/（mg prot·h）Na+-K+-ATPase 4.12±0.73 2.96±0.32＊＊3.26±0.36 3.02±0.74 3.34±0.53 3.65±0.69 3.34±1.34 Ca2+-Mg2+-ATPase 2.16±0.56 1.47±0.25＊＊1.58±0.26 1.66±0.54 1.84±0.25 1.92±0.23 1.84±0.78 Ca2+-ATPase 1.87±0.65 1.19±0.17＊＊1.41±0.27 1.33±0.46 1.45±0.20 1.64±0.75 1.27±0.49

3.2 腦組織細胞凋亡情況

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織凋亡細胞密度明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組和陽性對照組大鼠腦組織凋亡細胞密度明顯減小（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠腦組織細胞凋亡的顯微鏡圖見圖1，凋亡細胞密度測定結果見表2。

圖1 各組大鼠腦組織細胞凋亡的顯微鏡圖（×400）Fig 1 Microscope figure of cell apoptosis in brain tissue of rats in each group（×400）

表2 各組大鼠腦組織凋亡細胞密度、p-ERK1/2表達及p-ERK1/2/t-ERK1/2水平的測定結果（±s）Tab 2 Determination results of density of cell apoptosis，p-ERK1/2 expression，p-ERK1/2/t-ERK1/2 level in brain tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腦組織凋亡細胞密度、p-ERK1/2表達及p-ERK1/2/t-ERK1/2水平的測定結果（±s）Tab 2 Determination results of density of cell apoptosis，p-ERK1/2 expression，p-ERK1/2/t-ERK1/2 level in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

p-ERK1/2/t-ERK1/2（n=3）0.195 3±0.021 8 0.219 4±0.038 3 0.240 0±0.020 4 0.528 4±0.039 2##0.230 4±0.012 8 0.275 2±0.006 6#0.379 8±0.037 3##組別假手術組模型組陽性對照組氫溴酸樟柳堿高劑量組氫溴酸樟柳堿中劑量組氫溴酸樟柳堿低劑量組氫溴酸樟柳堿極低劑量組凋亡細胞密度，個/視野（n=4）5.75±2.50 22.25±5.19＊＊10.50±3.87##7.75±2.75##16.25±3.20#15.50±3.51#12.75±1.50##p-ERK1/2灰度值（n=6）0.326 5±0.046 7 0.332 8±0.031 7 0.335 2±0.066 8 0.348 3±0.060 2 0.344 2±0.023 6 0.340 1±0.043 1 0.343 2±0.037 6

3.3 腦組織中p-ERK1/2蛋白表達變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中p-ERK1/2表達輕微增強（P＞0.05）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組和陽性對照組大鼠腦組織中p-ERK1/2表達均輕微增強（P＞0.05）。各組大鼠腦組織中p-ERK1/2灰度值的測定結果見表2。

3.4 腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例輕微增加（P＞0.05）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿高、低、極低劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），其余差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠腦組織中p-ERK1/2、t-ERK1/2蛋白表達的電泳圖見圖2，p-ERK1/2/t-ERK1/2比例的測定結果見表2。

圖2 各組大鼠腦組織p-ERK1/2、t-ERK1/2蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of p-ERK1/2 protein expression，t-ERK1/2 protein expression in brain tissue of rats in each group

4 討論

Ca2+超載是CI/R重要的發病機制。腦缺血時細胞膜去極化引起Ca2+內流，加之膜磷脂降解及其產物均可引起ATP酶活性降低，進而可能影響細胞內Na+和Ca2+的聚積、K+的流失，從而加速細胞的損傷，故提高ATP酶的活性可能有助于腦保護[6]。本研究中，各劑量氫溴酸樟柳堿均表現出一定的提高腦組織ATP酶活性的作用，但差異無統計學意義（P＞0.05）；氫溴酸樟柳堿在1.2、0.3 mg/kg劑量時能顯著降低腦組織Ca2+含量（P＜0.05或P＜0.01），表明其對抗CI/R的機制可能與提高腦組織ATP酶活性和降低腦組織Ca2+含量有關。

細胞的凋亡和壞死所導致的神經細胞死亡幾乎是所有神經退化性疾病的顯著特征。缺血神經元凋亡具有延遲性，且呈可逆過程，這就為腦缺血的治療提供了時間[7]。盡管目前關于ERK信號通路在CI/R中的作用存在爭議，但一般認為ERK是生存通路，其在神經元的增殖分化以及抑制神經元凋亡中起著重要作用[8]。本研究中各劑量氫溴酸樟柳堿均可顯著減少CI/R模型大鼠腦組織凋亡細胞密度（P＜0.05或P＜0.01），除0.6 mg/kg劑量外均能顯著提高腦組織p-ERK1/2/t-ERK1/2水平（P＜0.05或P＜0.01），提示氫溴酸樟柳堿能對抗腦組織細胞凋亡，ERK1/2信號通路的激活可能是其作用的分子機制之一。

同時有研究提示，ERK激活后可降低N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體活性，抑制Ca2+內流，發揮神經元保護作用[9]。本研究中氫溴酸樟柳堿高、低劑量組p-ERK1/2/t-ERK1/2顯著升高，而腦組織Ca2+含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），該結果與文獻[9]報道吻合。

綜上，氫溴酸樟柳堿能抑制急性CI/R模型大鼠腦組織細胞凋亡，其作用機制可能與激活ERK1/2信號通路和調節ATP酶活性，進而降低腦組織Ca2+含量有關。

本研究中，不同劑量氫溴酸樟柳堿對各指標的影響存在差異，指標變化與給藥劑量變化趨勢不完全一致。結合本模型和藥物本身的特點分析其原因可能有以下幾方面：（1）腦缺血是一個復雜的快速級聯反應的病理過程，涉及Ca2+超載、細胞凋亡、氧化應激、氮化應激、能量代謝障礙、炎性細胞浸潤等諸多環節[10]。本研究是在不確定氫溴酸樟柳堿作用靶點和劑量的情況下從Ca2+超載和細胞凋亡方面進行了初步探討，可能無法很好體現其量效相關性。（2）氫溴酸樟柳堿屬于莨菪烷類生物堿，目前的研究報道顯示，莨菪烷類生物堿尚可通過調節神經遞質、保護線粒體、調節血管與血流等諸多方面對抗CI/R，由此筆者推測氫溴酸樟柳堿對本實驗模型的作用靶點可能也不是單一的而是多機制的。但其在不同的機制方面的藥效劑量存在差異，而對模型的治療結果是這多種機制綜合作用的結果，從而導致本研究結果的量效正相關不典型。再則，樟柳堿對學習記憶能力也呈現雙向調節作用，即在大于2.5 mg/kg時會損傷記憶，但在0.5 mg/kg以下則能促進學習記憶，表明樟柳堿的量效關系可能非傳統的量效正相關。但上述猜測還有待進一步研究以證實。

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Effects of Anisodine Hydrobromide on Cell Apoptosis and ERK1/2 Phosphorylation Level in Brain Tissue of Model Rats with Acute Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

CHEN Dandan1，2，XIE Xiaofang1，3，WAN Feng4，LIU Han1，ZHAO Shi1，CHEN Qiuling1，CHEN Yanqing4，PENG Cheng1，3（1.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.Dept.of Pharmacy and Examination，Ya’an Polytechnical College，Sichuan Ya’an 625000，China；3.State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Education，Chengdu 611137，China；4.Chengdu No.1 Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 610031，China）

OBJECTIVE：To study the effects of anisodine hydrobromide on cell apoptosis and extracellular signal-regulated protein kinase 1/2（ERK1/2）phosphorylation（p-ERK1/2）level in brain tissue of model rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury.METHODS：Rats were randomly divided into sham operation group，model group，positive control group（nimodipine 1.0 mg/kg），anisodine hydrobromide high-dose，medium-dose，low-dose，extreme low-dose groups（1.2，0.6，0.3，0.15 mg/kg），8 in each group.Suture method was used to establish the rat models with acute cerebral ischemia-reperfusion injury.Rats were intravenously injected once in tail at 2nd of ischemia and 6th of reperfusion.Then adenosine triphosphate（ATP）enzyme activity，Ca2+content，cell apoptosis in brain tissue，p-ERK1/2 protein expression in brain tissue，and p-ERK1/2/total ERK1/2（t-ERK1/2）proportion in brain tissue of rats were detected after 22 h of reperfusion.RESULTS：Compared with sham operation group，ATP enzyme activity in brain tissue of rats in model group was obviously decreased，Ca2+content was obviously increased，density of cell apoptosis in brain tissue was obviously increased，with statistical significances（P＜0.01）.Compared with model group，density of cell apoptosis in brain tissue was obviously decreased in each administration group；Ca2+contents in brain tissue of rats in positive control group，anisodine hydrobromide high-dose，low-dose groups were obviously decreased；and p-ERK1/2/t-ERK1/2 proportion in brain tissue of rats in anisodine hydrobromide high-dose，low-dose，extreme low-dose groups were obviously increased，with statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）；the other differences were not statistically significant（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Anisodine hydrobromide can inhibit the cell apoptosis in brain tissue of model rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury，and the mechanism may be related with activating ERK1/2 signal pathway and regulating ATP enzyme activity to decrease the Ca2+content in the brain tissue.

Anisodine hydrobromide；Acute cerebral ischemia-reperfusion； Rats； Cellapoptosis； Extracellularsignal-regulated protein kinase 1/2

R965

A

1001-0408（2017）28-3907-04

2016-12-01

2017-04-24）

（編輯：鄒麗娟）

國家基礎科學人才培養基金資助項目（No.J1310034）；四川省科技支撐計劃項目（No.16ZC1731）

＊講師，博士。研究方向：疾病動物模型與中藥復方藥理。電話：028-61800231。E-mail：chendandan619@126.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：疾病動物模型與中藥復方藥理。電話：028-61800231。E-mail：pengchengchengdu@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.06