陰炎凈洗劑對大鼠接觸性皮炎濕疹的防治作用及機(jī)制研究Δ

肖作奇，歐陽波，肖素希，潘濤（.湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部，長沙40008；.中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074）

陰炎凈洗劑對大鼠接觸性皮炎濕疹的防治作用及機(jī)制研究Δ

肖作奇1＊，歐陽波1#，肖素希2，潘濤1（1.湖南省婦幼保健院藥學(xué)制劑部，長沙410008；2.中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074）

目的：研究陰炎凈洗劑對大鼠接觸性皮炎濕疹（ACD）的防治作用及機(jī)制。方法：將60只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組（地塞米松）和陰炎凈洗劑高、中、低劑量組（分別給予2倍濃縮液、1倍濃縮液和原液），每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠均于腹、背（2 cm×2 cm）部涂布二硝基氯苯復(fù)制ACD模型。從造模第9天起，各給藥組大鼠背部涂布相應(yīng)藥物100μL，空白對照組和模型對照組大鼠涂布純化水100μL，每天給藥3次，連續(xù)10 d。給藥結(jié)束后，對皮膚變應(yīng)性反應(yīng)進(jìn)行評分并測定皮膚腫脹度；采用蘇木精-伊紅染色觀察皮膚病理變化；采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中白細(xì)胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-6和干擾素γ（IFN-γ）含量。結(jié)果：與空白對照組比較，模型對照組大鼠變應(yīng)性反應(yīng)評分和皮膚腫脹度均顯著升高（P＜0.01）；電鏡下可見表皮結(jié)痂壞死、真皮層損傷嚴(yán)重、毛囊壞死；血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），IL-6含量略有增加（P＞0.05）。與模型對照組比較，除陰炎凈洗劑低劑量組大鼠皮膚腫脹度、血清中IL-4含量以及各給藥組大鼠血清中IL-6含量改善不顯著外，其余指標(biāo)均顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：陰炎凈洗劑對大鼠ACD具有一定的防治作用，其機(jī)制可能與降低血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量有關(guān)。

陰炎凈；接觸性皮炎濕疹；白細(xì)胞介素；干擾素γ；大鼠

接觸性皮炎濕疹（ACD）是臨床常見的一種皮膚變態(tài)反應(yīng)性疾病，表現(xiàn)為皮膚紅腫、結(jié)痂或苔蘚化，嚴(yán)重者伴有皮膚壞死[1]。國內(nèi)外對于ACD的發(fā)病機(jī)制已有廣泛研究，認(rèn)為其主要是T淋巴細(xì)胞激活導(dǎo)致的免疫炎癥反應(yīng)，涉及白細(xì)胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-17等炎癥因子的激活與敏化[2]。目前，主要用于ACD治療的藥物有氯地松、地塞米松等糖皮質(zhì)激素類[3-4]和阿奇霉素等抗生素類[2]消毒止癢的化學(xué)藥品。而陰炎凈洗劑（湖南省婦幼保健院院內(nèi)制劑）是一種由蛇床子、地膚子、黃連、連翹、苦參等9味中藥組成的復(fù)方洗劑，其特點是作用溫和、毒副作用小，臨床主要用于婦科炎癥治療及婦產(chǎn)科護(hù)理中，但醫(yī)師在臨床工作中發(fā)現(xiàn)其對新生兒ACD有明顯療效。然而，陰炎凈洗劑對ACD的治療作用還缺乏藥理學(xué)實驗支持。因此，本研究通過復(fù)制大鼠ACD模型，考察陰炎凈洗劑在皮炎濕疹類疾病中的抗炎作用并初步探討其作用機(jī)制，為該藥的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

3020-353酶標(biāo)儀、D-34520高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DP72顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）；CP114電子天平（美國OHaus公司）。

1.2 藥品與試劑

陰炎凈洗劑（由湖南省婦幼保健院提供，批號：201612001，規(guī)格：250 mL/瓶）；地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：160502211，規(guī)格：1 mL∶5 mg）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，山東西亞化學(xué)股份有限公司，批號：W5656，臨用時配成1%和7%丙酮溶液）；大鼠IL-2、IL-4、IL-6和干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號均為：20161204）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，♀♂各半，鼠齡18 d，體質(zhì)量40～50 g，購自湖北省實驗動物研究中心（合格證書編號：42000600019184）。將大鼠分籠飼養(yǎng)于12 h明暗交替的環(huán)境中，環(huán)境溫度為18～21℃、相對濕度為（50±5）%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，可自由攝食、飲水。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組和陰炎凈洗劑高、中、低劑量組。除空白對照組外，其余各組大鼠在給藥前1 d均用電動剃毛刀去除腹部（2 cm×2 cm）的鼠毛，然后均勻涂布7%的DNCB丙酮溶液50 μL致敏；24 h后再用1%的DNCB丙酮溶液50 μL強(qiáng)化刺激；造模第5天時，除去大鼠背部（2 cm×2 cm）的鼠毛，并用1%的DNCB丙酮溶液50 μL致敏，然后每隔3 d重復(fù)敏化，一共3次。空白對照組大鼠采用不含DNCB的丙酮溶液給藥，其余操作相同。從造模第9天開始，空白對照組和模型對照組大鼠涂布純化水，陽性對照組大鼠涂布地塞米松注射液，陰炎凈洗劑高、中、低劑量組大鼠分別涂布陰炎凈洗劑2倍、1倍濃溶液和原液，每天早、中、晚各給藥1次，給藥劑量為100 μL，連續(xù)給藥10 d。

2.2 皮膚變應(yīng)性反應(yīng)評分及皮膚腫脹度測定

大鼠在造模后給藥前以及給藥10 d后，均采用EASI評估方案[5]進(jìn)行皮膚變應(yīng)性反應(yīng)評估評分：嚴(yán)重紅腫并有苔蘚化丘疹潰爛者，記4分；中度紅腫，結(jié)痂，無潰爛、苔蘚化者，記3分；有紅腫但無丘疹者，記2分；輕度紅腫者，記1分；無明顯病變者，記0分。并在給藥10 d后，用無菌手術(shù)煎分別煎下炎癥區(qū)皮膚和對應(yīng)側(cè)健康皮膚，用打孔器分別取1 cm×1 cm的皮膚，用電子分析天平稱質(zhì)量并記錄，以炎癥皮膚質(zhì)量與健康皮膚質(zhì)量之差表示皮膚腫脹度。

2.3 皮膚的病理觀察

將大鼠斷頭處死，取血并用手術(shù)剪取一小塊給藥部位中間部分的皮膚，置于培養(yǎng)皿中，用包埋劑OTC膠包埋，－40℃保存，冷凍切片（7 μm）。切片用甲醇洗脫30 s，甩干，行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微成像系統(tǒng)下觀察皮膚病理變化。

2.4 血清指標(biāo)檢測

將血樣于室溫下靜置20 min，然后在4℃條件下以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心10 min取血清，剔除溶血樣本。每組選取6只大鼠的血清樣本，每個樣本400 μL，分裝成每管 100 μL，－80 ℃凍存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行試驗，檢測血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 皮膚變應(yīng)性反應(yīng)評分與腫脹度測定結(jié)果

3.1.1 皮膚變應(yīng)性反應(yīng)評分結(jié)果 空白對照組大鼠給藥前、后均無病變，評分均為0；其余各組大鼠在造模后給藥前均可見典型的變應(yīng)性反應(yīng)特征，造模成功率為100%。在給藥10 d后，各給藥組大鼠皮膚的變應(yīng)性反應(yīng)均得到明顯改善，變應(yīng)性反應(yīng)評分較模型對照組大鼠均顯著降低（P＜0.01）。給藥前后各組大鼠皮膚病變照片見圖1，給藥后評分結(jié)果見表1。

圖1 各組大鼠皮膚病理變化的肉眼觀察結(jié)果Fig 1 Results of pathological changes of skin of rats by visual observation in each group

3.1.2 皮膚腫脹度測定結(jié)果 與空白對照組比較，其余各組大鼠的皮膚腫脹度均不同程度升高，除陰炎凈洗劑高劑量組外差異均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；與模型對照組比較，各給藥組大鼠的皮膚腫脹度均有不同程度降低，除陰炎凈洗劑低劑量組外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠變應(yīng)性反應(yīng)評分和皮膚腫脹度結(jié)果（±s）Tab 1 Results of allergic reaction scores and skin swelling degree of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠變應(yīng)性反應(yīng)評分和皮膚腫脹度結(jié)果（±s）Tab 1 Results of allergic reaction scores and skin swelling degree of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型對照組陽性對照組陰炎凈洗劑高劑量組陰炎凈洗劑中劑量組陰炎凈洗劑低劑量組皮膚腫脹度，g 0.112 8±0.015 6 0.203 2±0.037 8＊＊0.172 0±0.009 8＊＊#0.118 4±0.019 2##0.176 2±0.012 5＊＊#0.185 3±0.015 7＊＊n 10 10 10 10 10 10變應(yīng)性反應(yīng)評分0 3.2±0.42＊＊1.4±0.52＊＊##1.1±1.57＊＊##1.8±0.42＊＊##1.9±0.58＊＊##

3.2 HE染色后皮膚病理變化的觀察結(jié)果

與空白對照組比較，模型對照組大鼠的皮膚病理切片可見顯著表皮結(jié)痂壞死，真皮層損傷嚴(yán)重，毛囊壞死。與模型對照組比較，陰炎凈洗劑高劑量組大鼠皮膚明顯愈合；陽性對照組和陰炎凈洗劑中、低劑量組大鼠的皮膚愈合程度略差，可見表皮層壞死、難以區(qū)分真皮與表皮層，但是也有顯著改善，結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠皮膚病理變化的電鏡觀察結(jié)果（HE，×200）Fig 2 Results of pathological changes of skin of rats by electron microscopy in each group（HE，×200）

3.3 血清指標(biāo)檢測結(jié)果

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清中IL-4明顯升高，地塞米松注射液和中、高劑量陰炎凈洗劑能顯著降低血清中IL-4含量（P＜0.05），而低劑量陰炎凈洗劑作用不明顯。與模型對照組比較，各給藥組大鼠血清中IL-2、IFN-γ含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；IL-6含量略有上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），測定結(jié)果見圖3。

4 討論

圖3 各組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量測定結(jié)果（±s，n＝6）Fig 3 Determination results of contents of IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ in serum of rats in each group（±s，n＝6）

ACD模型是較為常見的一種研究皮炎濕疹的動物模型。DNCB誘發(fā)的ACD模型具有成功率高、重復(fù)性好等特點[6]。為了更接近反映陰炎凈洗劑對成年群體濕疹疾病的治療作用，筆者選用18日齡的未成年大鼠作為研究對象[7]。

治療皮炎濕疹的傳統(tǒng)中草藥有很多，治療手段有內(nèi)服、外用以及針灸。但是各種中藥療效不一，且對其藥理機(jī)制的闡述不是很清楚[8]。李傳應(yīng)等[9]研究白芍總苷對慢性皮炎濕疹的抗炎作用，提出其作用機(jī)制是降低ACD模型小鼠血清中IL-2、IL-4水平，且認(rèn)為其聯(lián)合糖皮質(zhì)激素給藥療效最佳；何文鳳等[10]則認(rèn)為變態(tài)反應(yīng)性皮炎主要是受白三烯（LT）受體和凋亡相關(guān)的半胱氨酸蛋白激酶14（Caspase-14）的影響；還有文獻(xiàn)報道，陳皮苷喂食可以明顯抑制DNFB誘發(fā)的皮炎，并認(rèn)為這是一種抗過敏機(jī)制[11]。以上研究均提示，中藥提取物治療皮炎濕疹可能是通過多層次、多靶點的作用，但主要是從抗炎和抗過敏機(jī)制兩個方面進(jìn)行探究。本研究主要通過初步考察陰炎凈洗劑在治療ACD中的抗炎作用，其抗過敏機(jī)制及更多作用在后續(xù)研究中有待進(jìn)一步完善。

據(jù)報道，ACD的發(fā)病機(jī)制為特異性的刺激引起皮膚內(nèi)CD8+殺傷細(xì)胞1/殺傷細(xì)胞17（Tc1/Tc17）和 CD4+T輔助細(xì)胞1/T輔助細(xì)胞17（Th1/Th17）細(xì)胞群激活，釋放IL-6、TNF-α、IL-18等炎性因子入血[12]，同時Th1和Th2細(xì)胞均能產(chǎn)生IL-2、IL-4和IFN-γ，從而導(dǎo)致炎癥發(fā)生[13-14]。本研究結(jié)果表明，陰炎凈洗劑能顯著改善ACD大鼠的皮膚變應(yīng)性反應(yīng)，且以高劑量組的治療效果尤為顯著，療效優(yōu)于糖皮質(zhì)激素類藥物地塞米松。并且從ELISA檢測結(jié)果看，陰炎凈洗劑能調(diào)節(jié)大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量，使給藥后的上述血清指標(biāo)含量趨于正常值。

綜上所述，陰炎凈洗劑對ACD具有較好的療效，且高劑量的作用效果優(yōu)于地塞米松。其作用機(jī)制可能與降低ACD大鼠血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量有關(guān)。

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Study on the Prevention and Treatment Effect and Its Mechanism of Yinyanjing Lotion on Allergic Contact Dermatitis in Rats

XIAO Zuoqi1，OUYANG Bo1，XIAO Suxi2，PAN Tao1（1.Dept.of Pharmaceutical Preparations，Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital，Changsha 410008，China；2.College of Biomedical Engineering，South-central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

OBJECTIVE：To study the prevention and treatment effect and its mechanism of Yinyanjing lotion on allergic contact dermatitis（ACD）in rats.METHODS：60 rats were randomly divided into blank control group，model control group，positive control group（dexamethasone）and Yinyanjing lotion high-dose，medium-dose，low-dose groups（respectively given 2-fold concentrated solution，1-fold concentrated solution and original solution），10 in each group.Except for blank control group，rats in other groups smeared dinitrochlorobenzene in the abdomen and back（2 cm×2 cm）to induce ACD model.From the 9th of modeling，rats in each administration group were smeared 100 μL of related drugs in the back，and rats in blank control group and model control group smeared 100 μL of purified water，3 times a day，for 10 d.After administration，skin allergic reaction was scored and skin swelling degree was determined.HE staining was used to observe the pathological changes of skin.Enzyme-linked immunosorbent method was used to detect the contents of interleukin-2（IL-2），IL-4，IL-6 and interferon γ（IFN-γ）in serum.RESULTS：Compared with blank control group，allergic reaction scores and skin swelling degree in model control group were significantly increased（P＜0.01）.Electron microscopy showed epidermal scab necrosis，dermal layer damage，hair follicle necrosis.Contents of IL-2，IL-4，IFN-γ in serum were significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）；IL-6 content was slightly increased（P＞0.05）.Compared with model control group，except that the skin swelling degree，IL-4 content in serum in Yinyanjing lotion low-dose group and IL-6 content in serum in each administration group were not significantly improved，other indexes were significantly improved（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Yinyanjing lotion has certain prevention and treatment effects on ACD in rats，the mechanism may be associated with reducing the contents of IL-2，IL-4，IFN-γ in serum.

Yinyanjing；Allergic contact dermatitis；Interleukin；Interferon γ；Rats

R285

A

1001-0408（2017）28-3931-04

2017-02-28

2017-05-15）

（編輯：林 靜）

湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（No.201671）

＊主管藥師，博士。研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及活性研究。電話：0731-84332262。E-mail：xiaozuoqi87@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥研究與開發(fā)。電話：0731-88905700。E-mail：1050495772@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.12