蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度優選及其對人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響Δ

劉 芳，董改英，瞿晶田，柴士偉（天津中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，天津 300193）

蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度優選及其對人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響Δ

劉 芳＊，董改英，瞿晶田，柴士偉（天津中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，天津 300193）

目的：優選蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度，并研究其對人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響。方法：采用柱前衍生化反相高效液相色譜法，以煎煮1次后4種主要氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的總煎出量為指標，對蘄蛇飲片及過1～8號篩部分進行篩選，優選蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。將人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞分為陰性對照組、陽性對照組（1 μmol/L甲氨蝶呤）和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組（2.0 mg/mL），分別作用48 h后，采用流式細胞術測定細胞凋亡率。結果：蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號篩，此時4種主要氨基酸總煎出量為（61.27±0.02）mg/g（n＝3）。與陰性對照組比較，最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），且略高于陽性對照組。結論：蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號篩；蘄蛇煮散劑具有誘導人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的作用。

蘄蛇；煮散劑；粉碎粒度；人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞；凋亡

蘄蛇為蝰科動物五步蛇[Agkistrodon acutus（Güenther）]的干燥體，性甘，味咸，有毒，歸肝經，具有祛風、通絡、止痙的功效，常用于治療風濕頑痹、麻木拘攣、中風口眼?斜、半身不遂、搐痙攣、破傷風、麻風、疥癬等疾病[1]。蘄蛇是我國傳統名貴中藥材之一，藥用資源短缺。因此，無論是從提高臨床療效，還是從節約資源的角度來講，對其進行合理有效的利用都具有重要的意義。

中藥煮散劑是指將飲片粉碎成顆粒與水共同煎煮后，去渣取汁制成的液體劑型，是與傳統湯劑相同的一種用藥形式。采用煮散劑可以達到節約藥材、提高湯劑煎煮質量等效果[2-3]。煮散劑的粉碎粒度影響著中藥有效成分的煎出量，有效成分的煎出量會隨著煮散劑粒度的變小呈現出先逐漸增高而后降低的趨勢。本研究擬在傳統中藥煮散理論的指導下，以煎煮1次（臨床常用煎煮方式）煎出的4種主要氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的總煎出量為指標，對蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度進行優選。并在此基礎之上，應用流式細胞技術，以細胞凋亡率為指標，評價最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑誘導人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的作用，初步揭示蘄蛇治療類風濕性關節炎的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀、G1314B紫外-可見檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；AL104電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CKX31倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；Dynex MrxⅡ酶標儀（美國Dynex公司）；Dikma Diamonsil C18柱（中國迪馬科技有限公司，規格：150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑

注射用甲氨蝶呤（山西普德藥業有限公司，批號：20130531，規格：5 mg/支）；天冬氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：100%）、谷氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：99.5%）、L-羥脯氨酸對照品（批號：111578-200201，純度：99.5%）、甘氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；MTT（美國Sigma公司，批號：9BT10330）；硫酸鏈霉素（華北制藥有限公司，批號：080902）；熒光素FITC標記的膜聯蛋白Ⅴ/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）凋亡試劑盒（美國基礎基因聯盟生物公司，批號：556547）；甲醇和乙腈為色譜純，異硫氰酸苯酯及其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

蘄蛇（河北美威藥業股份有限公司，批號：140201），經我院王中華副主任藥師鑒定為真品。

1.4 滑膜組織

試驗所需滑膜標本取自2013年4月－2014年8月在我院確診為類風濕性關節炎的6例住院患者（診斷標準符合1987年美國風濕病協會修訂的分類標準），其中女性5例、男性1例，年齡范圍為（58±6）歲，滑膜標本經手術病理標本檢查證實。

2 方法

2.1 成纖維樣滑膜細胞的分離與鑒定

將無菌取出的滑膜組織漂洗后放在平皿中，盡量剪碎，放入離心管，加0.25%Ⅱ型膠原酶于恒溫振蕩器上連續消化3次，每次20 min。合并3次消化液后過6號金屬篩，收集細胞懸液。將細胞懸液置于離心管中，以離心半徑為8 cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用含有雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養液將細胞制成細胞懸液，吹打均勻，調整細胞密度為1×105mL－1，接種于細胞培養瓶中。將細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進行培養，隔日更換培養基。待細胞鋪滿80%瓶底時，用0.25%胰蛋白酶常規消化、傳代。取細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察。

2.2 蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度的確定

取蘄蛇原藥材，粉碎。根據粉碎粒度的不同，將其分為飲片和過1～8號篩部分。分別精密稱取蘄蛇飲片或各過篩部分0.90 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加超純水50 mL，稱質量，然后分別加熱回流提取1 h，放冷，再次稱質量，用超純水補足減失的質量。之后，參考文獻[4]方法，采用柱前衍生化反相高效液相色譜法分別測定各溶液中4種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸）的煎出量，以4種氨基酸的總煎出量為指標，確定蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。

2.3 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑對成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響

2.3.1 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑冷凍干燥物的制備 取最佳粉碎粒度篩蘄蛇煮散劑50.00 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱回流提取1 h，抽濾，用旋轉蒸發儀回收水溶液。濃縮物進行冷凍干燥，得蘄蛇最佳粉碎煮散劑凍干粉5.77 g。

2.3.2 煮散劑凍干粉對成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響考察 取3～5代生長穩定的成纖維樣滑膜細胞，用DMEM/F12培養液調整細胞密度為5×105L－1，取4 mL細胞懸液復種于25 cm2培養瓶中。將試驗分為陰性對照組、陽性對照組和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組。待培養瓶中成纖維樣滑膜細胞生長融合后（培養72 h），最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細胞加入4 mL的最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑冷凍干燥物（2.0 mg/mL）的DMEM/F12溶液；陽性對照組細胞加入1μmol/L甲氨蝶呤，陰性對照組細胞加入空白DMEM/F12溶液。繼續培養48 h后，用2.5 g/L的胰酶消化1 min左右，收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，然后按AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作染色，隨即進行流式細胞術分析。

2.4 統計學方法

采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 成纖維樣滑膜細胞的分離鑒定結果

顯微鏡下可見，細胞呈梭狀成纖維樣，為人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞，結果見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞的形態觀察結果（×100）Fig 1 Morphology result of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes under inverted microscope（×100）

3.2 蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度的考察結果

蘄蛇飲片和不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑水煎煮1次后測定，結果過6號篩蘄蛇煮散劑中4種氨基酸的煎出量均最高，總煎出量為（61.27±0.02）mg/g，因此蘄蛇煮散劑最佳粉碎粒度為過6號篩，結果見表1。

3.3 最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑對成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響結果

表1 蘄蛇飲片及不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑4種氨基酸煎出量的測定結果（±s，n＝3，mg/g）Tab 1 Determination results of amounts of 4 amino acids in Agkistrodon decoction pieces and Agkistrodon decocting powderwith different crushing particle sizes（±s，n＝3，mg/g）

表1 蘄蛇飲片及不同粉碎粒度蘄蛇煮散劑4種氨基酸煎出量的測定結果（±s，n＝3，mg/g）Tab 1 Determination results of amounts of 4 amino acids in Agkistrodon decoction pieces and Agkistrodon decocting powderwith different crushing particle sizes（±s，n＝3，mg/g）

粉碎度飲片過1號篩過2號篩過3號篩過4號篩過5號篩過6號篩過7號篩過8號篩天冬氨酸2.58±0.07 5.56±0.19 5.63±0.16 7.57±0.29 8.33±0.33 9.88±0.22 10.29±0.17 10.63±0.17 9.96±0.19谷氨酸5.27±0.12 9.72±0.26 10.02±0.24 13.42±0.43 14.97±0.63 16.75±0.33 18.23±0.33 18.66±0.36 17.34±0.31 L-羥脯氨酸1.73±0.01 6.17±0.26 5.67±0.02 7.34±0.02 8.03±0.13 8.30±0.22 8.76±0.14 8.37±0.08 6.43±0.08甘氨酸6.50±0.08 16.38±0.09 15.42±0.18 19.97±0.20 21.78±0.12 22.92±0.69 24.00±0.37 23.21±0.15 18.75±0.17總煎出量16.08±0.27 37.84±0.43 36.74±0.57 48.30±0.91 53.10±0.95 57.85±0.39 61.27±0.02 60.86±0.34 52.48±0.39

2.0 mg/mL蘄蛇煮散劑可促進成纖維樣滑膜細胞凋亡。與陰性對照組比較，陽性對照組和最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細胞總凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。陰性對照組、陽性對照組、最佳粉碎粒度蘄蛇煮散劑組細胞總凋亡率分別為（2.71±1.05）%、（23.29±1.85）%、（28.07±1.45）%（n＝3），流式圖見圖2。

圖2 各組細胞凋亡率測定的流式圖Fig 2 Flow cytometry of apoptosis rate determination of cell in each group

4 討論

現代藥理學證實，蘄蛇具有抗炎、鎮痛的作用[5-6]，能夠緩解膠原誘導性關節炎大鼠的癥狀，其作用機制可能與降低血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量和升高血清中白細胞介素10（IL-10）含量有關[7]。進一步研究發現，蘄蛇發揮作用的有效成分為Ⅱ型膠原蛋白類成分[8]。考慮到蛋白類成分水解后為氨基酸，因此本研究以煎煮劑中4種主要氨基酸成分的總煎出量為指標，參考阿膠中氨基酸的測定方法[9-10]——柱前衍生化法進行含量測定，并對其進行了部分優化，以確定蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度。本研究結果顯示，粉碎粒度對蘄蛇多肽類物質的煎出率具有明顯的影響，隨著粉碎粒度的逐漸變小，蘄蛇4種氨基酸的煎出量逐漸增加，達到最大值后又逐漸變小。當蘄蛇煮散劑過6號篩后，4種總氨基酸的總煎出量達到最大，并且明顯高于傳統飲片。

本研究所用細胞為從類風濕性關節炎患者身上提取的成纖維樣滑膜細胞，細胞狀態比經過改造的能穩定遺傳的細胞株更能反映細胞的實際病理狀態。筆者認為，從患者身上取得的標本，由于只進行滑膜細胞的提取，故排除了其他因素對試驗結果的影響。由于1 mL細胞培養液最多能溶解2.00 mg蘄蛇煮散劑的冷凍干燥物，故本研究細胞凋亡試驗中蘄蛇煮散劑的最大質量濃度為2.0 mg/mL。本研究結果顯示，過6號的篩蘄蛇煮散劑（2.0 mg/mL）具有一定的誘導人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的作用，細胞凋亡率為（28.07±1.45）%（n＝3）。

綜上所述，蘄蛇煮散劑的最佳粉碎粒度為過6號篩。蘄蛇煮散劑在細胞模型基礎上具有一定的誘導人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的作用，其在體內是否具有相同的作用、作用強度如何，都需要應用動物模型進一步驗證。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：372.

[2] 姚佳音.煮散劑研究進展[J].上海中醫藥雜志，2014，48（9）：93-95.

[3] 張衛，張瑞賢.煮散劑的劑量與興衰[J].中國醫學創新，2014，11（3）：94-96.

[4] 柴士偉，董改英，瞿晶田，等.正交試驗優選蘄蛇煎煮工藝[J].中國藥房，2015，26（25）：3569-3571.

[5] 蔣福升，馬哲龍，陳金印，等.蘄蛇提取物抗炎鎮痛藥理作用的研究[J].蛇志，2013，25（2）：97-99.

[6] 谷恒存，丁興紅，馬哲龍，等.蘄蛇水提液對佐劑性關節炎大鼠的免疫調節作用[J].中華中醫藥雜志，2012，27（10）：2676-2678.

[7] 張紀達，范永升，溫成平，等.蘄蛇水提取物對膠原誘導性關節炎大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10的影響[J].中華中醫藥雜志，2012，27（5）：1407-1409.

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Optimization of the Best Crushing Particle Size of Agkistrodon Decocting Powder and Its Effect on Apoptosis of Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes

LIU Fang，DONG Gaiying，QU Jingtian，CHAI Shiwei（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To optimize the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder，and study its effect on apoptosis of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.METHODS：Pre-column derivatization RP-HPLC was adopted.Using the total decoction amounts of 4 main amino acids（aspartic acid，glutamic acid，L-hydroxyproline，glycine）that decocted once as index，the Agkistrodon decoction pieces and those through No.1-8 seive were screened，and the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder was optimized.The human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes were divided into negative control group，positive control group（1 μmol/L methotrexate）and the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder group（2.0 mg/mL），flow cytometry was used to determine the cell apoptosis after cultured for 48 h.RESULTS：The best crushing particle size was through No.6 seive，when the total amount of 4 main amino acids was（61.27±0.02）mg/g（n＝3）.Compared with negative control group，the apoptosis rate in the best crushing particle size of Agkistrodon decocting powder group was significantly increased（P＜0.05），which was slightly higher than positive control group.CONCLUSIONS：The best crushing particle size is through No.6 seive；and Agkistrodon decocting powder shows effect on reducing the apoptosis of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.

Agkistrodon；Decocting powder；Crushing particle size；Human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes；Apoptosis

R932

A

1001-0408（2017）28-3935-03

2017-01-03

2017-06-29）

（編輯：林 靜）

天津市中醫中西醫結合科研課題（No.13060）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：中藥臨床藥學。電話：022-27987205。E-mail：tjcs008@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.13