復方五指毛桃顆粒的提取工藝研究Δ

孫麗娜，劉小虹，劉建博，邵瑤昕，黃慧婷，張志強，王碩輝，王振華#（.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州50006；.廣州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，廣州 50405；.廣州中醫藥大學科技產業園有限公司，廣州50445）

復方五指毛桃顆粒的提取工藝研究Δ

孫麗娜1＊，劉小虹1，劉建博2，邵瑤昕3，黃慧婷2，張志強1，王碩輝1，王振華1#（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州510006；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，廣州 510405；3.廣州中醫藥大學科技產業園有限公司，廣州510445）

目的：優化復方五指毛桃顆粒的提取工藝。方法：以復方五指毛桃顆粒提取液中補骨脂素、苦杏仁苷的轉移率及出膏率為指標，采用U12（6×4×3）均勻設計表安排試驗，考察加水倍量、提取時間、提取次數3個因素對提取工藝的影響，并通過3次放大試驗對優化工藝進行驗證。結果：優化工藝為加10倍量水、提取3次、每次60 min。在此條件下，提取液中補骨脂素、苦杏仁苷的轉移率及出膏率分別為82.51%（RSD＝1.45%，n＝3）、93.69%（RSD＝0.85%，n＝3）、18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），工藝驗證結果均置于預測值的95%置信區間內。結論：優化的提取工藝穩定、可行，為該制劑的后續開發提供了科學依據。

復方五指毛桃顆粒；均勻設計；提取工藝；補骨脂素；苦杏仁苷

復方五指毛桃顆粒由五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥組成，常用于肺脾氣虛型穩定期慢性阻塞性肺疾病的治療，臨床療效顯著[1]。原方以煎劑內服用于臨床，但煎煮、攜帶、使用均不方便。由于本方日服劑量較大、出膏多，根據處方的特點，現擬將這一臨床驗方開發成顆粒，方便用藥。本文旨在以五指毛桃中補骨脂素及燀苦杏仁中苦杏仁苷的轉移率和出膏率為指標，采用均勻設計安排試驗，對復方五指毛桃顆粒的提取工藝進行優化，為后續制劑開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；MU4100P實驗室超純水系統（上海淼康實業公司）；HDM-1000數顯控溫電熱套（金壇市榮華儀器公司）；HH-6A數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子、太子參及白術藥材飲片（均購自廣州市藥材公司中藥飲片，批號分別為：YPA4A0001、YPA4D0001、YPA5D0001、YPA2F0001、YPA3A0001、YPA3C0001），經廣州中醫藥大學王振華副教授鑒定及檢驗：五指毛桃符合《廣西壯族自治區壯藥質量標準（第二卷）》項下相應規定，其他藥材均符合2015年版《中國藥典》（一部）項下相應規定；補骨脂素對照品（批號：110739-201416，純度：99.9%）、苦杏仁苷對照品（批號：110820-201506，純度：93.4%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 提取液中苦杏仁苷的含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為75.39 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥材共97 g，加8倍量水，加熱提取2次，每次1 h，合并濾液。精密量取水提液5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻、過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 缺燀苦杏仁陰性樣品溶液制備 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、紫蘇子等5味藥材（缺燀苦杏仁）87 g，同“2.1.2”項下方法提取、制備成缺燀苦杏仁陰性樣品溶液。

2.1.4 色譜條件 參考文獻[2-3]確定色譜條件。色譜柱：YMC-Pack Pro C18RS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：207 nm；進樣量：10 μL。理論板數以苦杏仁苷峰計應不低于6 000。

2.1.5 方法學考察 取上述3種溶液進樣測定，結果陰性樣品無干擾，專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 苦杏仁苷高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of amygdalin

精密稱取苦杏仁苷對照品適量，加甲醇制備成質量濃度為 9.42、18.85、37.70、75.39、113.09、150.78、188.48 μg/mL的對照品溶液，進樣測定。以苦杏仁苷的質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得回歸方程為y＝10 219x+2 370.2（r＝0.999 9），表明苦杏仁苷的檢測質量濃度線性范圍為9.42～188.48 μg/mL。按照相關要求進行方法學考察，結果，在精密度試驗中，對照品溶液峰面積的RSD為0.12%（n＝6）；重復性試驗中供試品溶液峰面積的RSD為0.46%（n＝6）；穩定性試驗中，供試品溶液放置16 h內含量的RSD為0.13%（n＝6）；準確度試驗中平均加樣回收率為102.15%（RSD＝1.43%，n＝6）。

2.2 提取液中補骨脂素的含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制備成質量濃度為5.02 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 同“2.1.2”項下。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按處方比例稱取茯苓、燀苦杏仁、紫蘇子等5味藥材（缺五指毛桃）共67 g，同“2.1.2”項下方法提取、制備成缺五指毛桃陰性樣品。

2.2.4 色譜條件 參考文獻[4]確定色譜條件。色譜柱：YMC-Pack ODS-AM（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：245 nm；進樣量：10 μL。理論板數以補骨脂素峰計應不低于8 000。

2.2.5 方法學考察 取上述3種溶液進樣測定，結果陰性樣品未見干擾，專屬性良好，色譜圖見圖2。

圖2 補骨脂素高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of psoralen

精密稱取補骨脂素對照品適量，加甲醇制備成質量濃度為0.50、1.00、2.01、5.02、8.02、12.04、15.04 μg/mL 的對照品溶液，進樣測定。以補骨脂素質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得回歸方程為y＝77 006.9x+566.9（r＝0.999 9），表明補骨脂素的檢測質量濃度線性范圍為0.50～15.04 μg/mL。按照相關要求進行方法學考察，結果，在精密度試驗中，對照品溶液峰面積的RSD為0.13%（n＝6）；重復性試驗中供試品溶液峰面積的RSD為0.31%（n＝6）；穩定性試驗中供試品溶液放置16 h內含量的RSD為0.16%（n＝6）；準確度試驗中平均加樣回收率為101.13%（RSD＝1.43%，n＝6）。

2.3 出膏率測定

精密量取后文均勻試驗中的提取液50 mL，置于恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒質量，計算出膏率[（m1－m2）×V1/（V2×m）×100%，其中m為藥材量，m1為蒸發皿恒質量與干膏質量之和，m2為蒸發皿恒質量，V1為提取液總體積，V2為量取的提取液體積]。

2.4 提取工藝均勻試驗

2.4.1 因素與水平選擇 通常對中藥材提取影響比較大的因素有提取時間、提取次數、溶劑量等，參考文獻[5-7]及預試驗結果，以提取液中補骨脂素、苦杏仁苷的轉移率[轉移率＝（ma/mb）×100%，ma為提取液中指標成分含量，mb為處方對應藥材中指標成分含量（五指毛桃中補骨脂素含量為0.069%、燀苦杏仁中苦杏仁苷含量為2.99%）]及出膏率為指標對以上述3個因素進行考察，各因素的水平選取見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

由于試驗考察的因素水平較多，故采用均勻設計安排試驗。根據均勻設計方法[8]，按U12（6×4×3）設計安排試驗。

2.4.2 均勻試驗設計與結果 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、炒紫蘇子等6味藥材共97 g，根據表1設計試驗，加水提取、過濾、合并濾液。按“2.1”“2.2”項下方法測定提取液中苦杏仁苷和補骨脂素的含量并計算轉移率，按“2.3”項下方法測定出膏率，試驗設計與結果見表2。

表2 均勻試驗設計與結果Tab 2 Design and results of uniform test

2.4.3 數據處理 以補骨脂素轉移率（Y1）、苦杏仁苷轉移率（Y2）、出膏率（Y3），對加水倍量（X1）、提取時間（X2）、提取次數（X3）及X12、X22、X32采用SPSS 20.0軟件進行線性逐步多元回歸分析[9-10]（P＜0.05進入，P＞0.1剔除）。結果如下：Y1＝17.272X1－0.882X12+0.09X2+65.172X3－11.692X32－99.558（R＝0.999 7，S＝1.97，F＝171.51，P＜0.01）；Y2＝0.182X12+0.332X2－ 0.003X22+41.028X3－6.384X32+3.096（R＝0.999 7，S＝1.34，F＝223.50，P＜0.01）；Y3＝0.044X2+8.731X3－1.386X32+2.802（R＝0.989 0，S＝0.55，F＝121.38，P＜0.01）

根據上述方程可知，X1、X3與Y1成二次函數關系，從提高補骨脂素轉移率角度考慮，當X1＝10、X3＝3時Y1有較優解；X2、X3與Y2也成二次函數關系，從提高苦杏仁苷轉移率角度考慮，當X2＝60、X3＝3時Y2有較優解。綜合考慮，擬定的提取工藝條件為加10倍量水，提取3次，每次60 min。此時，Y1、Y2、Y3預測值分別為：Y1預＝80.65±3.86，Y2預＝96.06±2.63，Y3預＝19.16±1.08；Y預測＝Y方程±Uα×S[Uα（0.01）＝2.576，Uα（0.05）＝1.960]。

2.4.4 結果驗證 按處方比例稱取五指毛桃、茯苓、燀苦杏仁、紫蘇子等6味藥材共485 g，各3份，加10倍量水，加熱提取3次，每次60 min，合并濾液，同“2.1”“2.2”“2.3”項下方法測定提取液中苦杏仁苷、補骨脂素含量并計算轉移率及出膏率，結果見表3。

表3 提取工藝驗證結果Tab 3 Verification results of extraction technology

工藝驗證結果表明，在優化工藝條件下，補骨脂素、苦杏仁苷的平均轉移率及出膏率分別為82.51%（RSD＝1.45%，n＝3）、93.69%（RSD＝0.85%，n＝3）、18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），實測值置于預測結果的95%置信區間內，提示優化后的工藝穩定、可行。

3 討論

3.1 考察指標的選擇

提取液化學成分中補骨脂素常被用作評價方中君藥五指毛桃質量優劣的指標[4，11-12]，苦杏仁苷為苦杏仁藥材中止咳平喘的有效成分[13]。因此，從質量控制、藥理等方面分析，以二者的轉移率作為考察指標均具有一定的意義；且二者極性差異大，能較全面地反映藥材被提取的程度。出膏率作為輔助性指標，為劑型的選擇提供了依據。

提取液中苦杏仁苷既為藥效成分，也屬于內源性毒性成分，含量過高時易導致氫氰酸中毒[14]。因本研究主要針對提取工藝，注重的是藥材被提取利用的程度，對于制劑中苦杏仁苷可能造成的毒性效應，后期筆者將通過開展制劑的系統毒理學和藥理學研究，合理設計藥物臨床使用劑量，保證臨床用藥的安全性和有效性。

3.2 數據分析變量的引入

在進行線性回歸預分析時，筆者曾選擇以Y1、Y2、Y3對 2 組分析變量[（X1、X2、X3、X12、X22、X32）、（X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X2、X2X3、X1X3、X1X2X3）]進行了逐步回歸分析，結果前者擬合出的方程線性關系更好，引入方程的變量均具有統計學意義（P＜0.01），因此在數據分析時，選擇了前者。

結合表2實測值及數據分析結果可知，加水量及提取次數2個因素對補骨脂素提取率有顯著影響，提取時間及提取次數2個因素對苦杏仁苷提取率有顯著影響，提取次數為二者共同的顯著性因素，故確定藥材提取3次。加水量為10倍量時補骨脂素提取效果最優，提取時間為60 min時苦杏仁苷提取效果最優。因此綜合各指標考慮，確定工藝條件為藥材加10倍量水，提取3次，每次60 min。

本研究采用均勻設計安排試驗，使各試驗在試驗點范圍內充分地均勻分散，并結合生產實際，選取對提取效率影響較大的溶劑倍量、提取時間及提取次數為因素，合理安排各因素水平，對試驗結果進行線性回歸分析，預測出最優工藝條件參數。通過進行3次放大驗證工藝預測，得出補骨脂素、苦杏仁苷的平均轉移率及出膏率與均勻設計預測結果一致，優化出了經濟、簡便、穩定、可行的提取工藝，可為復方五指毛桃顆粒的后續開發奠定基礎。

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Study on the Extraction Technology of Compound Radix Fici Hirta Granule

SUN Lina1，LIU Xiaohong1，LIU Jianbo2，SHAO Yaoxin3，HUANG Huiting2，ZHANG Zhiqiang1，WANG Shuohui1，WANG Zhenhua1（1.College of TCM，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.Dept.of Respiratory，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China；3.Science and Technology Park Co.，Ltd.，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510445，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound radix fici hirta granule.METHODS：Using the transfer rate of psoralen and amygdalin in extraction liquid of Compound radix fici hirta granule and extraction rate as indexes，U12（6×4×3）uniform design was used for the test，the effects of amount of adding water，extraction time，extraction times on the extraction technology were investigated，and optimized technology was verified by three pilot scale tests.RESULTS：The optimal technology was as follow as 10-fold water，extracting for 3 times，60 min each time.Under the conditions，transfer rate of psoralen and amygdalin and extraction rate were 82.51%（RSD＝1.45%，n＝3），93.69%（RSD＝0.85%，n＝3），18.89%（RSD＝0.74%，n＝3），respectively.The validated results were in the 95%confidence interval of predictive value.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable and feasible，and provides the scientific basis for the follow-up development of the preparation.

Compound radix fici hirta granule；Uniform design；Extraction technology；Psoralen；Amygdalin

R284.2

A

1001-0408（2017）28-3976-04

2017-01-25

2017-03-07）

（編輯：劉 萍）

廣東省中醫藥強省建設專項資金醫院中藥制劑建設項目（No.粵中醫辦函〔2015〕102號）；廣東省科技計劃項目（No.2014B050-502013、2014B040404066、2015B020234003）

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型、新技術。E-mail：1083532885@qq.com

#通信作者：副教授，碩士生導師。研究方向：藥物新劑型、新技術。E-mail：wzh@gzucm.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.24