路德維希腸桿菌EM1對二氯喹啉酸和Cd2+復合污染的修復

徐淑霞,杜文濤,王曉雅,張繼冉,趙 培,吳 坤

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路德維希腸桿菌EM1對二氯喹啉酸和Cd2+復合污染的修復

徐淑霞,杜文濤,王曉雅,張繼冉,趙 培,吳 坤*

(河南農業大學生命科學學院,農業部農業微生物酶工程重點實驗室,河南鄭州 450002)

為解決稻田水體環境中農藥與重金屬的復合污染問題,利用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜等分析技術,研究了路德維希腸桿菌()EM1對二氯喹啉酸-Cd2+復合污染的修復機理.結果表明,EM1能在以二氯喹啉酸為單一碳源的條件下對Cd2+進行吸附.在溫度為35℃,pH為6.0的條件下培養7d,EM1對50mg/L的二氯喹啉酸和Cd2+的降解及吸附率達到最大,分別為30%和60%.掃描電鏡結果表明,復合修復過程中菌體形態發生變化,菌體表面分泌大量胞外聚合物.紅外掃描分析顯示,脅迫條件下菌體細胞壁結構并未發生變化,菌株降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+的過程主要與菌體表面的羥基、酰胺基、糖環中的C-O-C及脂肪族化合物有關.

二氯喹啉酸；Cd；路德維希腸桿菌EM1；吸附；復合污染

復合污染是指兩種或兩種以上污染物存在于同一環境介質中所引起的污染.近年來,由于人類生活質量的提高和工農業的不斷發展導致了不同種類的有機化合物(除草劑、塑料、單寧、多酚等)和無機化合物(鎘、銅、鉛、鉻、汞等)進入環境并共存,形成復合污染.有機和無機化合物的復合污染是一種普遍的全球問題.多種不同污染物共存時,往往會相互作用和影響,從而改變彼此的環境行為和生態毒性[1].二氯喹啉酸作為一種特效選擇性生長激素類除草劑,半衰期較長難以降解,導致此類農藥在土壤及水體中大量殘留[2-3],嚴重影響水稻等作物的產量和品質.Cd2+在電鍍工業和冶金工業中應用廣泛,Cd2+被人和動物吸收后,選擇性地在肝臟和腎臟中蓄積,嚴重損傷腎小管,從而引起糖尿、蛋白尿等一系列癥狀[4].農藥與重金屬復合污染是我國水體和土壤環境中普遍存在的污染形式并對農產品安全和人體健康構成嚴重威脅.因此,必須重視土壤復合污染問題,探索經濟高效的復合污染修復技術,為國家糧食安全及農業的可持續發展奠定基礎.

微生物修復技術由于具有對污染物降解徹底、無二次污染、費用低、綠色環保等優點正成為人們研究的熱點.目前,二氯喹啉酸和重金屬Cd2+在環境中的殘留與安全性逐漸被人們所重視,但對其殘留毒害的研究和處理還處于探索階段,相關報道較少.范俊等[5]在長期施用二氯喹啉酸的土壤中分離篩選出了一株細菌QC06,并確定了該菌株在二氯喹啉酸濃度為50mg/L、pH 7.0、溫度30℃的最佳降解條件下,培養至第7d對二氯喹啉酸的降解率可達95.31%; Polti等[6]則分離出五株能夠同時去除重金屬Cd2+和農藥林丹的放線菌,其中放線菌M7對兩種污染物的去除率都較高,達40%左右; Olaniran[7]調查了鉛和汞的存在下微生物對1,2-二氯乙烷在土壤中降解產生負面的影響,并發現生物刺激對1,2-二氯乙烷微生物降解產生積極的影響.

目前,國內外對有機污染物和重金屬單一污染的研究較多,而針對水體中二氯喹啉酸和重金屬Cd2+復合污染生物修復方面的研究報道還比較少.本研究以實驗室前期分離的路德維希腸桿菌()EM1為出發菌株,該菌在降解二氯喹啉酸的同時高效吸附重金屬Cd2+,研究EM1降解二氯喹啉酸和吸附重金屬Cd2+的最佳條件以及機理,以期為除草劑和重金屬復合污染的生物修復實踐提供理論依據和技術支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 路德維希腸桿菌EM1,由實驗室分離篩選得到.

無機鹽培養基(g/L):K2HPO41.0,NaH2PO41.0,CaCl2×H2O 0.02,MgSO4×7H2O 0.2,NH4NO31.0, FeCl3×3H2O 0.05,pH 7.0.

LB培養基(g/L):NaCl 10.0,胰蛋白胨10.0,酵母浸粉5.0,pH值7.0.

1.1.2 試驗儀器 2695型高效液相色譜儀,美國waters公司;原子吸收分光光度計,日本HITACHI Co公司;JSM.6490LV掃描電子顯微鏡,德國Hettick公司;VERTEX70傅里葉變換紅外光譜,美國waters公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度對EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的影響 實驗分別在兩組裝有50mL無機鹽培養基的250mL錐形瓶中進行,分別添加二氯喹啉酸、CdCl2,使其初始濃度均為50mg/L(含Cd2+培養基中添加0.1%的葡萄糖作為碳源),調pH值為7.0,接種處于對數期的菌種,分別于25℃、30℃、35℃、40℃和45℃條件下振蕩培養7d.高效液相色譜、原子吸法分別測定溶液中二氯喹啉酸和Cd2+的濃度,確定菌株EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的最佳溫度.

1.2.2 pH值對EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的影響 在裝有50mL無機鹽培養基的250mL錐形瓶中分別添加二氯喹啉酸、CdCl2,使其初始濃度均為50mg/L(含Cd2+培養基中添加0.1%的葡萄糖作為碳源),調pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,接種處于對數期的菌種,35℃條件下,振蕩培養7d,測定二氯喹啉酸和Cd2+的濃度,確定EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的最佳pH值.

1.2.3 EM1對不同濃度Cd2+及二氯喹啉酸復合污染的降解 在裝有50mL無機鹽培養基的250mL錐形瓶中添加二氯喹啉酸和CdCl2,Cd2+的初始濃度均為50mg/L,二氯喹啉酸初始濃度分別為50,100,200mg/L,調pH值為7.0,35℃條件下振蕩培養12d,每天取樣,測定溶液中二氯喹啉酸和Cd2+的濃度.

1.2.4 EM1對二氯喹啉酸-Cd2+復合污染的解吸 復合修復實驗在含有50mg/L二氯喹啉酸的無機鹽培養基中進行,實驗組中Cd2+的初始濃度分別為50,100,200mg/L, 35℃條件下振蕩培養7d,每天取樣一次.以添加0.1%葡萄糖但不添加CdCl2的無機鹽培養基作為對照.

1.2.5 掃描電鏡分析 分別取于二氯喹啉酸初始濃度均為50mg/L,Cd2+的初始濃度分別為50,100,200mg/L的無機鹽培養基中,35℃條件下振蕩培養7d的菌懸液(以在不添加任何試劑的無機鹽培養基中生長的菌體作空白對照),離心(8000r/min,5min)后加入新鮮的2.5%戊二醛溶液固定2~4h[8].固定后的菌體離心(8000r/min,5min),棄上清,磷酸緩沖液清洗3次,乙醇梯度脫水, 30%、50%、70%、85%、95%各一次,100%乙醇脫水2次,每次10~20min.乙酸異戊酯置換2次,每次20min.處理后的菌體干燥,噴金.

1.2.6 紅外光譜分析 取于二氯喹啉酸初始濃度均為50mg/L,Cd2+的初始濃度分別為50、100、200mg/L的無機鹽培養基中, 35℃條件下振蕩培養7d的菌懸液(以在不添加任何試劑的無機鹽培養基中生長的菌體作空白對照),菌體離心干燥后與KBr粉末混和均勻研磨成細粉[9],細粉填入壓片模具在壓片機中壓制成透明薄片,于FTIR樣品倉進行測定.

1.3 檢測方法

二氯喹啉酸濃度的測定:樣品離心(10000r/ min,15min,4℃)后,上清液經0.45μm濾膜過濾,HPLC色譜檢測.HPLC色譜條件:50mm× 4.0mm,5μm,C18柱,流動相為(甲醇):(1%冰乙酸)=60:40,流速1mL/min,檢測波長240nm,柱溫35℃.

Cd2+濃度的測定:樣品離心(10000r/min, 15min,4℃),上清經2%的稀硝酸稀釋定容后,利用原子吸收分析儀檢測.

2 結果與討論

2.1 溫度對EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸性能的影響

溫度是微生物在生長代謝過程中最基本的環境因素.圖1顯示在溫度為25~45℃的范圍內,菌株EM1均可對Cd2+及二氯喹啉酸進行不同程度的吸附和降解,且隨著溫度的升高,吸附率和降解率也隨之增大.當溫度為35℃時,吸附率和降解率達到最大,分別為90%和41%.溫度在菌體吸附重金屬離子時起到很重要的作用,溫度會影響細胞壁的穩定性及結合位點表面官能團的電離,從而影響微生物吸附重金屬的過程[10].隨著溫度的升高,當溫度為45℃時吸附率則下降為30%,這表明溫度升高條件下,細菌細胞壁表面結構基團的變化及金屬結合位點活性的降低,可能是導致吸附率下降的原因.同樣在菌株EM1 對二氯喹啉酸的降解過程中,隨著溫度的升高,二氯喹啉酸的降解率也出現明顯的下降趨勢,當溫度為45℃時,降解率僅為12%.以上結果表明,菌體吸附Cd2+和降解二氯喹啉酸的最適溫度為35℃.

2.2 pH值對EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸性能的影響

微生物在生長過程中需要適宜的pH值范圍,pH值過高或過低均會影響菌體的生長.圖2結果表明,pH值對菌體吸附Cd2+和降解二氯喹啉酸的影響較大,酸性和堿性的條件均會降低菌體對Cd2+的吸附率和二氯喹啉酸的降解率.在重金屬被吸附的過程中氫離子濃度是一個重要的因素,生物吸附能力取決于生物量的多少及菌體表面所帶電荷可與金屬離子位點結合的多少[11].當溶液體系中pH值較低時,H+濃度較高,從而形成大量的H3O+占據菌體表面大多數的金屬結合位點,抑制Cd2+與相關基團的結合,進而導致吸附率降低.隨著pH值的升高.當pH值為6.0時,生物質表面官能團的離解度增加,靜電相互作用增強,生物質表面的負電荷也隨之增多,因此促進了對帶正電的Cd2+的富集.隨著pH值的進一步升高,當pH值為9.0時,Cd2+的富集率降低為43%,這可能是由于pH值偏堿性時,Cd2+與溶液中的OH-形成沉淀,進而導致Cd2+吸附率的降低.而在菌株EM1對二氯喹啉酸的降解過程中,pH值同樣可以通過改變細胞質膜的透性、膜結構的穩定性及電離性影響菌體細胞對營養物質的吸收,從而影響微生物的生長速率及酶的活性,進而影響菌株EM1對二氯喹啉酸的降解.綜上,菌株EM1的生長適合偏酸性的環境,對Cd2+吸附和二氯喹啉酸降解的最適pH值分別為6.0和7.0.

2.3 菌株EM1對不同濃度Cd2+的吸附及二氯喹啉酸的降解

任何一種具有去除污染物能力的微生物都會對相應的污染物表現出一定的耐受能力.圖3顯示,在不同濃度條件下,菌體培養到第7d時,對Cd2+的吸附率和二氯喹啉酸的降解率均達到最大.當Cd2+初始濃度為50mg/L時,菌株EM1對重金屬Cd2+的吸附效果最好,吸附率為90%.當Cd2+濃度逐漸增大時,吸附效果緩慢下降,可能是高濃度的Cd2+對菌株EM1產生毒害作用,逐漸抑制其生長,從而影響重金屬Cd2+的吸附.重金屬吸附率的高低還與細菌的吸附位點及飽和度有關.當Cd2+的初始濃度較低時,微生物的吸附位點未達到飽和,去除率較高.隨著Cd2+濃度的增加,吸附逐漸達到飽和,導致去除率降低.對于二氯喹啉酸的降解,當二氯喹啉酸初始濃度為50mg/L時,菌株EM1對二氯喹啉酸的降解效果最好,降解率為40%.當二氯喹啉酸濃度增大時,降解效果下降,可能是高濃度的二氯喹啉酸對菌體產生毒害作用,抑制其生長,從而影響二氯喹啉酸的降解.以上結果表明,菌株EM1對Cd2+和二氯喹啉酸均表現出一定的耐受能力,且對兩種污染物的最適耐受濃度均為50mg/L,較高的Cd2+和二氯喹啉酸濃度會導致菌體蛋白質變性,降低細菌體內與生長代謝有關的酶活性,從而抑制菌體的生長和代謝,影響細菌的生長.

2.4 復合修復時EM1對二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附

復合修復結果如圖4和圖5所示.當二氯喹啉酸和Cd2+初始濃度均為50mg/L時, EM1對二氯喹啉酸和Cd2+的降解和吸附效果最好,分別為30%和60%.當二氯喹啉酸濃度保持不變,Cd2+濃度逐漸增大時, EM1對二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附效果緩慢下降.Cd2+濃度為100mg/L時,EM1對二氯喹啉酸和Cd2+的降解和吸附率分別為30%和42%.Cd2+濃度為200mg/L時,降解和吸附率分別為6%和10%.這可能是由于脅迫作用的增強,高濃度的Cd2+對菌株EM1產生毒害作用,逐漸抑制其生長,也可能是二氯喹啉酸和Cd2+復合污染對細菌的生長代謝產生協同抑制作用,從而對二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附產生較大的影響.復合修復實驗結果表明, EM1能在以二氯喹啉酸為單一碳源的條件下對Cd2+進行吸附,進而達到復合修復的效果.

2.5 EM1復合修復前后的形態變化

二氯喹啉酸和Cd2+同時存在時,EM1的降解和吸附前后菌體電鏡掃描結果如圖6所示.圖6a為對照組,6b、6c、6d中二氯喹啉酸的濃度為50mg/L,Cd2+的濃度分別為50,100,200mg/L.

從圖6a對照組可以看出,菌體呈短桿狀,細胞形態規則,表面飽滿,胞外無明顯的分泌物.在二氯喹啉酸和Cd2+脅迫條件下,菌體細胞開始出現嚴重的褶皺變形(b、c、d),周圍出現大量的絮狀分泌物,并伴隨菌體之間的成簇聚集現象.隨著脅迫作用的增強,胞外分泌物增加,聚集作用更加明顯.有研究表明胞外多聚物在抵抗外界重金屬脅迫過程中具有重要作用,它不僅為重金屬離子提供眾多的結合位點,同時也是其進入細胞的一道選擇性屏障[12-13].在本研究中EM1可能通過菌體表面分泌的絮狀多聚物對自身形成保護屏障,進而阻止外界有毒物質尤其是重金屬離子的進入,從而緩解復合脅迫引起的毒性損傷,保證菌體存活.因此推測,圖6中出現的絮狀或片狀分泌物為EM1降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+時產生的有機分泌物(多糖、胞外酶或少量蛋白質).

a: 對照; b:50mg/L的二氯喹啉酸+50mg/L的 Cd2+;c: 50mg/L的二氯喹啉酸+100mg/L的 Cd2+;d:50mg/L的二氯喹啉酸+ 200mg/L的Cd2+

2.6 復合修復前后EM1的紅外光譜分析

紅外吸收光譜主要是由于分子的振動及轉動能級躍遷產生的吸收,而分子的振動和轉動決定于分子的原子組成、空間分布及化學鍵性質等分子結構與組成的特征.利用物質對紅外光的吸收可對待測物進行定性、定量及結構的分析,因此通過傅里葉紅外光譜能夠識別細菌吸附重金屬前后細菌細胞壁主要官能團的變化[14].常用的紅外光譜的范圍主要在波數為4000~400cm-1的中紅外光譜區,該區域主要能級躍遷類型為分子中基團振動和分子轉動,大多數有機物和無機物的化學鍵的基頻吸收均在此譜區內,是有機物結構及定性分析應用較多的區域.

紅外光譜圖如圖7所示.光譜圖顯示菌體所含組分復雜,在4000~400cm-1范圍內均有吸收. 4000~2500cm-1區域主要為 X—H含氫基團的伸縮振動.圖中,在3600~3200cm-1范圍內出現較寬的吸收帶并于3432cm-1處有最大吸收峰,該寬峰來自于O—H的伸縮振動,主要由菌體中的糖類、脂肪酸等組分貢獻[15].復合修復后3432cm-1處的羥基峰出現大約10cm-1的紅移且鋒型寬化,吸收強度增強,這表明部分羥基參與了Cd2+的吸附過程,使O—H鍵長增加,振動峰紅移.2927與2959cm-1處的峰分別來自于有機物中的—CH3、—CH2基團,是比較典型的脂碳鏈中C—H鍵的伸縮振動吸收帶,該峰的出現能夠直觀的反映出菌體細胞壁及細胞膜組分中親水及親脂物質的信息[16];2400~2100cm-1為叁鍵和累積雙鍵區,主要包括C≡C、C≡N、C=C=C、O=C=O鍵的伸縮振動,與其它區域相比實驗組在該范圍內有明顯的新峰出現,而本研究中菌體所利用的碳源,二氯喹啉酸是一類具有芳香性的雜環化合物其開環產物的基團振動形式與該區域基團頻率區的吸收譜帶相符,因此推測該處新峰的出現可能與吸附在菌體表面的二氯喹啉酸的分解代謝產物有關;1500~400cm-1區域主要為C—C,C—O,C—N, C—X等(碳水化合物、蛋白質和脂類)伸縮振動和含氫基團的彎曲振動;1648cm-1處的吸收峰來自酰胺Ⅰ帶,是C=O的伸縮振動;1542cm-1處的峰譜為酰胺Ⅱ帶,是C—N的伸縮振動與N—H的彎曲振動[17];1396cm-1處的峰則為酰胺Ⅲ帶,是N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動引起的,可能還有羧基C—O的伸縮振動及P=O、C=S的伸縮振動的貢獻,其中酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的譜峰為蛋白質的特征性峰帶[18]; 1238cm-1處的峰主要由C=S、S=O、P=O等重原子的雙鍵伸縮振動引起;1066cm-1處的峰為糖類的特征峰,吸收峰由糖環的C—O—C伸縮振動引起[19].當Cd2+的濃度增大時該處的峰型寬化,尖而窄且強度增強.電鏡結果顯示隨著Cd2+濃度的升高,胞外分泌物增加,由此可知脅迫過程中菌體胞外分泌大量的多糖類物質參與重金屬的吸附過程從而達到復合修復的目的;615cm-1處的峰來自脂肪族化合物[20],由C—Cl、C—Br和C—I的伸縮振動引起,紅外光譜圖顯示隨著脅迫作用的增強該處峰的吸收強度也隨之增強且鋒型銳化表明脂肪族化合物也參與了菌體的復合修復.

圖7 EM1對二氯喹啉酸和Cd2+復合修復前后的紅外光譜

Fig.7 FTIR spectra of the strain EM1grow in quinclorac and heavy metal Cd2+before and after the restoration

a:對照; b:50mg/L二氯喹啉酸+50mg/L Cd2+;c: 50mg/L二氯喹啉酸+100mg/L Cd2+;d: 50mg/L二氯喹啉酸+200mg/L Cd2+

通過對紅外光譜圖的分析可知,復合體系除在2400~2100cm-1的叁鍵和累積雙鍵區有明顯的新峰出現外,實驗組的紅外光譜峰形基本一致,一些特征峰只在部分波段吸收位置和強度發生了變化(3432、1648、1542、1066及615cm-1處發生紅移)出現波峰強弱的區別.以上結果表明: EM1在降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+的復合修復過程中菌體表面的羥基、酰胺基、糖環中的C-O-C及脂肪族化合物是吸附、螯合或絡合金屬離子的主要活性基團.

3 結論

3.1 EM1能夠以二氯喹啉酸為唯一碳源,且對Cd2+進行吸附.對Cd2+吸附和二氯喹啉酸降解的最適溫度為35℃,最適pH值分別為6.0和7.0.單一污染條件下EM1對50mg/L Cd2+及二氯喹啉酸的吸附率和降解率最高分別為92%和41%.復合修復時,當二氯喹啉酸的初始濃度為50mg/L,重金屬Cd2+的初始濃度分別為50、100、200mg/L時, EM1對Cd2+和二氯喹啉酸的吸附率和降解率分別為60%和30%,42%和30%,10%和6%.

3.2 掃描電鏡結果顯示,對照組中菌株EM1呈短桿狀,表面光滑,菌體分散,個體形態明顯,細胞間無胞外物質相連.復合修復過程中菌體形態差異明顯,菌體周邊產生大量的胞外分泌物,并伴隨著嚴重的集聚現象.

3.3 紅外光譜圖的分析結果表明,菌株EM1降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+后,細胞成分及整體結構并未發生變化,紅外光譜圖的峰型基本保持一致,只是一些特征峰的吸收位置和強度發生了變化,參與吸附作用的為菌株EM1表面的羥基,酰胺基,糖環中的C—O—C及脂肪族化合物.

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Bioremediation of the combined pollution of quinclorac and Cd2+byEM1.

XU Shu-xia, DU Wen-tao, WANG Xiao-ya, ZHANG Ji-ran, ZHAO Pei, WU Kun*

(Key Laboratory of Enzyme Engineering, College of life sciences, Henan Agricultural University, Zhengzou 450002, China)., 2017,37(8)：3159~3165

Basing on the study of degradation and adsorption characteristics of quinclorac and cadmium, bacteria EM1 was used as the test strain. The interaction mechanism of quinclorac-Cd2+combined pollution withEM1was investigated by using SEM and FTIR analytical techniques. The experimental results showed that the strains could adsorb Cd2+with quinclorac as the sole carbon source. After 7d culture at a temperature of 35℃, pH 6.0, the degradation and adsorption of quinclorac and Cd2+in 50mg/L reached the maximum, which were 30% and 60% respectively. The SEM results showed that in the process of composite repair the morphology of the cells was changed and a large number of extracellular polymeric substances were secreted in the cell surface. Infrared scanning analysis showed that the changes had not taken place in the cell walls under the stress condition. Hydroxy, aminoacyl, carbon-oxygen- carbon bond in the sugar ring and the aliphatic compounds were confirmed to be the key functional groups for the strain to biodegrade quinclorac and adsorb Cd2+.

quinclorac；Cd；EM1；biosorption；combined pollution

X172

A

1000-6923(2017)08-3159-07

徐淑霞(1971-),女,河南靈寶人,副教授,博士,主要從事環境污染物的微生物轉化和修復研究.發表論文42篇.

2016-12-21

河南省重點科技攻關項目(152102110054);河南省高等學校重點科研項目(15A180005);河南省高校科技創新團隊支持計劃(15IRTSTHN014)

* 責任作者, 教授, wukun63@126.com