雙酚A對斑馬魚幼魚神經遞質和神經行為的影響

楊麗華，史奇朋, 2，周炳升, *

1. 中國科學院水生生物研究所 淡水生態與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072. 中國科學院大學，北京 100049

雙酚A對斑馬魚幼魚神經遞質和神經行為的影響

楊麗華1，史奇朋1, 2，周炳升1, *

1. 中國科學院水生生物研究所 淡水生態與生物技術國家重點實驗室，武漢 430072. 中國科學院大學，北京 100049

環境濃度水平下雙酚A(BPA)暴露對生物體的毒性效應受到廣泛關注。以早期發育階段斑馬魚為模型，評價了環境濃度下BPA暴露對斑馬魚幼魚運動行為的影響，并探討了可能的作用機制。將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度BPA(0、1、3、10和30 μg·L-1)后，斑馬魚幼魚的整體平均運動速率顯著降低。低濃度組幼魚在持續光照條件下的運動行為顯著降低，同時5-羥色胺受體(htr1a)的轉錄水平增加十分顯著，表明BPA可能通過5-羥色胺受體對斑馬魚的運動行為產生影響。而高濃度組幼魚在第2個黑暗刺激周期的活動過度受到抑制，同時多巴胺受體(d1r)的轉錄水平顯著降低，表明BPA可能通過多巴胺受體影響斑馬魚對外界刺激的響應。HPLC分析結果表明，5-羥色胺和多巴胺神經遞質含量在所有濃度組均顯著升高。進一步分析與早期神經發育(wnt1, shha)、單胺類遞質神經元分化(lmx1a, nr4a2和syn2a)以及遞質合成(tph1b, th)相關的基因和蛋白水平，發現神經遞質含量的升高可能是由于BPA促進了斑馬魚胚胎早期神經發育和單胺類遞質神經元的分化。綜上，環境濃度下BPA暴露即可對斑馬魚的運行行為產生影響，提示BPA污染很可能對生態環境及人體健康產生潛在的危害。

雙酚A；斑馬魚；神經行為；神經遞質

Received22 January 2017accepted8 March 2017

Abstract: Toxic effects of bisphenol A (BPA) on organisms after exposure to environmentally relevant concentrations have received great concerns. In this study, embryos of zebrafish were exposed to series of concentrations (0, 1, 3, 10 and 30 μg·L-1) of BPA, and changes in behavior and the underlying mechanisms were studied. Our results indicated that embryonic exposure to BPA caused a significant decrease in average swimming speed of larval zebrafish. Specifically, larval activity was significantly decreased in a continuous light period in groups of lower concentrations and in the next dark stimulating period in groups of higher concentrations after exposure to BPA. Transcriptional changes of htr1a and d1r indicated these receptors might be responsible for the effects observed above. HPLC analysis showed exposure to BPA increased the contents of dopamine and 5-HT at all treatments examined. Further results of expression of genes and proteins related to neurodevelopment of monoamine neurons (wnt1, shha, lmx1a, nr4a2, syn2a) and rate limiting enzymes for synthesis of dopamine and 5-HT (th, tph1b) provided evidences for our hypothesis that BPA could accelerate neurogenesis and neural differentiation thus resulting in increased number of monoamine neurons. Generally, exposure to environmental relevant levels of BPA could affect neurodevelopment and result in behavioral changes in zebrafish larvae, indicating potential risks for wild animals and human due to BPA pollution.

Keywords: bisphenol A; zebrafish; neurobehavior; neurotransmitter

雙酚A(Bisphenol A, BPA)由剛性平面芳環和可塑的非線性脂肪側鏈組成，具有無色透明、輕巧耐用、防沖擊性強等優點，因此作為一種重要的工業原料被廣泛應用到日常生活的各個方面，比如電子設備、體育器材、醫療器械、餐具、以及食品包裝等[1]。這些產品的大量使用造成了BPA在環境介質中的廣泛分布。在自然水體中，BPA的含量通常為ng·L-1級別。我國珠江三角洲水體中的BPA濃度范圍為4～377 ng·L-1[2]。生活污水及工業廢水中的BPA含量非常高。如在美國污水處理廠及曾檢測到BPA含量為3.642 μg·L-1[3]，加拿大某工廠排出的廢水中BPA含量高達230～149 ng·L-1或200 ng·L-1[4]。BPA在沉積物中的含量通常為ng·g-1級別，如北京溫榆河底沉積物檢測到BPA為0.6～59.6 ng·g-1[5]。此外，在各種生物及人類體內都檢測到了BPA的存在[2]。近來的研究表明，BPA在非常低的劑量下(遠低于FDA推薦的安全劑量)即可對哺乳動物產生影響[6-7]，因此環境濃度水平下BPA暴露對生物體的毒性效應研究對于BPA的生態風險評價和管理至關重要。

BPA已被證實具有內分泌干擾效應，它可以通過干擾甲狀腺激素、雌激素和雄激素受體等對生物體產生有害效應[8-11]。內源性激素對于生物體內神經發育特別是胚胎發育早期階段具有十分關鍵的作用，并且BPA可以通過血腦屏障[12]，因此雙酚A很可能對生物體早期神經發育及相關功能產生影響。嚙齒動物研究表明，BPA可以誘導神經行為的改變，并且這種改變很有可能和動物體內神經遞質有關。如Ishido等[13]研究表明BPA可以通過多個環節增加中腦多巴胺活性，導致運動行為異常、注意力降低等不良后果。但生物體的神經行為調控機制十分復雜，其與神經遞質的關系也尚不明確。因此，本研究的主要目的為以早期階段斑馬魚為模型，以運動行為為終點評價低劑量下BPA的神經毒性效應，并從分子水平上揭示BPA對斑馬魚早期神經發育和神經遞質的影響，探討BPA導致神經毒性的可能作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

BPA(純度> 97%, CAS 85-05-7)購自美國Acros Organics(Thermo Fisher Scientific, New Jersey, US)，助溶劑二甲基亞砜(DMSO)(色譜純)購自美國Sigma Chemical公司(St. Louis, MO, USA)。Trizol試劑購自Invitrogen公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。熒光定量試劑盒購于日本的Toyobo(Osaka, Japan)公司。其他常規試劑為分析純。

1.2 斑馬魚飼養及胚胎暴露

野生型AB系斑馬魚在(28±0.5) ℃的活性炭過濾的密閉循環水系統中培養，光周期(14 h光照∶10 h黑暗)，每天喂豐年蟲2次。收集魚卵的前一天晚上將雄魚和雌魚以2∶1的比例置于同一缸中，次日燈光刺激產卵收集。用活性炭過濾自來水清洗魚卵，剔除異物。在解剖鏡下取發育正常的囊胚期斑馬魚胚胎(2 hour post fertilization, hpf)，隨機分配于含有500 mL暴露工作液的玻璃培養皿中(200顆/皿)，BPA暴露濃度依次為0, 1, 3, 10和30 μg·L-1，其中DMSO濃度均為0.005%(V/V)，并且設置0.005% DMSO(V/V)為對照組。每個濃度設置5個平行并且每天更換暴露液，并記錄孵化數量和死亡數量，及時清除死亡個體。暴露至120 hpf后，每個濃度組隨機選取幼魚進行運動行為分析，其余幼魚用清洗3～5次后，迅速液氮冷凍后保存于-80 ℃。

1.3 常規發育指標

根據記錄數據計算120 hpf的孵化率、存活率和畸形率，計算方法如下：

孵化率=成功孵化數量/胚胎總數

存活率=存活的幼魚數量/成功孵化數量

畸形率=成功孵化后的畸形數量/存活數量

1.4 幼魚運動行為分析

每個濃度組隨機選取30條健康幼魚(6條/平行)進行運動行為分析。斑馬魚幼魚的運動行為量化分析采用ZebraLab行為分析系統(ViewPoint Life Sciences, Montreal, Canada)。斑馬魚幼魚(120 hpf)置于24孔板中，每孔放置一條魚，保持溫度為28 ℃。實驗前適應10 min然后開始監測運動行為。首先在20 min的持續光照下記錄幼魚的運動軌跡，而后使用20 min的光暗周期刺激記錄幼魚運動軌跡(5 min光-5 min暗-5 min光-5 min暗)。每30秒采集一次行為學數據(運動的頻率、距離和總時間)。記錄的數值用在線Open Office.Org 2.4軟件分析數據(http://www.openoffice.org)。

1.5 神經遞質含量測定

神經遞質含量通過高效液相色譜-電化學聯用儀(HPLC-ECD, ESA, Chelmsford, MA, USA)測定。50條幼魚為一個平行樣(每個濃度組2個平行樣)，在500 μL 0.1 mol·L-1的高氯酸中進行超聲破碎，4 ℃、10 000 × g離心10 min，取上清液經0.22 μm的聚乙烯膜過濾，而后進行上機檢測(每個平行樣做3個重復)。檢測條件如下：色譜柱為C18(250 mm×3 mm, 5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶磷酸鹽緩沖液(60 nmol·L-1NaH2PO4，50 mmol·L-1乙二胺四乙酸和2 mmol·L-1正十八烷基磺酸鈉鹽，pH=3.8) = 4∶7∶89，流速為0.8 mL·min-1。

1.6 蛋白質表達水平分析

每個濃度組隨機選取400條幼魚(100條/皿，合并為2個平行樣)進行western blot分析。蛋白質提取使用南京凱基公司的全蛋白提取試劑盒，按照說明書操作進行，蛋白質含量檢測使用碧云天生物技術的BCA蛋白檢測試劑盒。蛋白質樣品(每個平行樣做2個重復，每個重復取50 μL樣品)以6%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離，電轉至PVDF膜(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。然后將PVDF膜于37 ℃封閉1 h，加入一抗(MBP, AnaSpec, Fremont, CA, USA, 1:800；SYN2a, Synaptic Systems, G?ttingen, Germany, 1:1000；或glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 1:1000)于4 ℃過夜。將膜取出，加入辣根過氧化物酶標記二抗(羊抗兔，Proteintech, Wuhan, China, 1:5000)，室溫孵育2 h。目標帶的分子量和凈光密度值使用Western blot圖象處理系統(FluorChem Q; Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)進行分析。

1.7 基因轉錄水平分析

總RNA提取使用Trizol法(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。NanoDrop-2000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies Inc., Wil-mington DE, USA)測定總RNA的濃度及質量。cDNA的合成采用PrimeScript?reagent Kit (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)試劑盒按照其說明書進行。在定量檢測之前使用在線工具http://www.leonxie.com/ referencegene.php評估了較為常用的5個內參基因(rpl8, 18s,β-actin, gapdh, ef1α)在BPA暴露下的轉錄穩定性，最后選取rpl8作為內參基因。熒光定量PCR采用日本Toyobo公司(Osaka, Japan)的SYBR Green試劑盒，于ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA)進行檢測。擴增程序為：95 ℃×10 min變性，95 ℃×30 s，60 ℃×15 s，72 ℃×45 s，35個循環。反應結束后繪制溶解曲線用于檢驗是否有非特異性產物。對照組和每個暴露濃度組中均設置3個平行樣(30條/平行樣)，每個樣品2個重復。實驗中所用的基因引物序列采用在線引物設計軟件Primer 3 program (http://frodo.wi.miT.edu/)設計，引物序列見表1。目的基因轉錄水平的相對變化使用2-△△CT法進行計算處理。

1.8 數據處理與分析

所有的數據分析均使用SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)軟件。實驗數據的正態性用Kolmogorov-Smirnov test檢測，方差齊性檢驗采用Levene's test方法；如有需要用對數轉換使之符合方差齊性。實驗組與對照組間差異顯著性分析用one-way ANOVA方法，顯著性水平為P<0.05，結果表示以算術平均值 ± 標準誤差(mean ± SEM)。作圖使用Origin 8.0軟件完成。

2 結果(Results)

2.1 常規發育指標

統計結果顯示暴露于BPA沒有顯著影響斑馬魚胚胎/幼魚的孵化率、存活率、畸形率等指標(表2)。所有濃度組斑馬魚胚胎孵化率均大于85%，存活率大于95%。

2.2 幼魚運動行為

BPA暴露斑馬魚5 d后，行為分析顯示：在整個實驗周期內，暴露于3、10和30 μg·L-1BPA的幼魚平均運動速率顯著下降(P < 0.05)(圖1A)。在連續光照下，在3 μg·L-1BPA暴露組，運動速率顯著下降(P < 0.05)。在光暗交替刺激下，第1個5 min黑暗刺激下，幼魚運行行為無顯著變化；第1個5 min光照內，暴露于3、10和30 μg·L-1的幼魚速率均顯著下降(P < 0.05)；在第2個5 min黑暗階段暴露于10和30 μg·L-1的幼魚速率均顯著下降(P < 0.05)；第2個5 min光照下，所有BPA暴露組的幼魚運動速率均顯著下降(P < 0.05)(圖1.B)。

圖1 BPA暴露對斑馬魚幼魚運動行為的影響注：A，整個試驗周期內平均運動速率；B，光暗周期內平均運動速率。*P < 0.05，** P < 0.01。Fig. 1 Effect of BPA on locomotor behavior of larval zebrafish (Danio rerio)Note: A, average swimming speed during the test; B, average swimming speed during light-dark stimulating photo period. *P < 0.05, ** P < 0.01.

表1 定量PCR所用引物信息Table 1 Primers for q-RT-PCR utilized in this study

表2 BPA暴露對斑馬魚胚胎發育的影響Table 2 The effects of BPA exposure on zebrafish embryos

圖2 BPA暴露對斑馬魚幼魚體內多巴胺及5-HT含量的影響注：*P < 0.05。Fig. 2 Effect of BPA on contents of dopamine and 5-HT in larval zebrafish (Danio rerio) Note: *P < 0.05.

2.3 神經遞質含量的變化

HPLC-ECD分析結果顯示，經BPA暴露后斑馬魚幼魚體內多巴胺及5-羥色胺的含量在所有處理組均顯著升高(P < 0.01)(圖2)。

2.4 基因轉錄水平的變化

熒光定量PCR結果顯示(圖3)，nr4a2、syn2a和htr1a的轉錄水平在所有BPA暴露組幼魚體內均顯著增加(P < 0.05)；tph1b和th的轉錄水平在3、10和30 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內顯著增加，而shha的轉錄水平在上述濃度組顯著降低(P < 0.05)；wnt1在10和30 μg·L-1BPA暴露組顯著增加(P < 0.05)；lmx1a的轉錄水平在1 μg·L-1濃度組顯著降低(P < 0.05)，而在10和30 μg·L-1濃度組顯著升高(P < 0.05)；d1r在3 μg·L-1濃度組顯著升高而在30 μg·L-1濃度組顯著降低(P < 0.05)。

圖3 BPA暴露對斑馬魚幼魚基因轉錄水平的影響注：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。 Fig. 3 Effect of BPA on transcription of genes in larval zebrafish (Danio rerio) Note: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.

2.5 蛋白表達水平的變化

western blot分析結果表明(圖4)，LMX1A蛋白表達水平在3 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內顯著降低(P < 0.05)，而在30 μg·L-1暴露組幼魚體內顯著增加(P < 0.05)；SYN2α蛋白的表達水平在1和3 μg·L-1BPA暴露組幼魚體內顯著降低(P < 0.05)，而在10和30 μg·L-1濃度組變化不顯著。

3 討論(Discussion)

本研究以早期發育階段斑馬魚為模型，評價了環境濃度下BPA暴露對斑馬魚幼魚運動行為的影響，并探討了可能的作用機制。結果表明，胚胎期暴露于3 μg·L-1BPA即可影響孵化后幼魚在持續光照和光暗刺激條件下的運行行為，這種影響可能與神經遞質含量及功能的變化有關。同時我們的結果還表明，斑馬魚幼魚體內的神經遞質在低濃度和高濃度BPA暴露下的響應機制不同。

斑馬魚幼魚的運動行為在第1個持續光照周期內，僅在較低濃度(3 μg·L-1)出現了顯著降低；而在第2個黑暗刺激周期內，高濃度組幼魚的活動過度受到抑制。同時，在整個試驗周期內，斑馬魚幼魚的平均運動速率顯著降低。Gioiosa等[14]也觀察到類似的結果，他們將發育期小鼠暴露于甲氧滴滴涕和BPA，結果發現小鼠成年后的運動能力降低。Farabollini等[15]的研究表明，圍產期BPA暴露可以減輕雄性后代的焦慮樣行為，降低雌性和雄性子代的探究能力。但是還有一些研究表明，BPA暴露可以導致實驗動物活動過度。如Ishido等[16]發現腦池內注射BPA 4周后可以增加自發性運動，Mizuo等[17]的研究表明胚胎期和哺乳期BPA暴露也可以導致運動活力增加。BPA暴露還可以改變對外界刺激的響應，如胚胎期和哺乳期BPA暴露也可以導致幼鼠對嗎啡反應的改變[17]，成年大鼠暴露于BPA后，其在疼痛或恐懼刺激條件下的運動行為加劇[18]。上述結果表明，胚胎階段暴露于BPA可以降低孵化后幼魚在持續光照條件下的自發性行為以及光暗交替刺激條件下的應激性運動行為。

圖4 BPA對斑馬魚幼魚神經發育相關蛋白表達水平的影響注：A，LMX1A的western blot分析結果；a，LMX1A蛋白的相對表達量；B，SYN2α的western blot分析結果； b，SYN2α蛋白的相對表達量。* P<0.05。Fig. 4 Effect of BPA on protein related to neurodevelopment in larval zebrafish (Danio rerio)Note: A, western blot analysis of LMX1A; a, relative expression of LMX1A; B, western blot analysis of SYN2α; b, relative expression of SYN2α. * P<0.05.

雖然生物體神經行為的調控機制尚不清楚，但是神經遞質多巴胺和5-羥色胺及其受體在其中的關鍵作用已經得到證實。Hidaka等[19]的研究表明，多巴胺受體拮抗劑可以使實驗動物在刺激條件下表現出的運動過度消失，而5-羥色胺受體可能參與自發性活動的調節。本研究中，htr1a的轉錄水平在低濃度組增加十分顯著，這可能與觀察到的第1個持續光照條件下運行行為降低有關。而在高濃度組，多巴胺受體(d1r)的轉錄水平受到顯著抑制，這可能與第2個黑暗刺激階段斑馬魚幼魚的運動行為變化有關。因此我們推測，在不同濃度BPA暴露條件下，斑馬魚幼魚體內神經遞質系統的響應機制存在差異。

然而當我們進一步檢測這2種神經遞質的含量時發現，各BPA暴露組斑馬魚幼魚體內神經遞質的含量均出現非常顯著的升高。類似地，Nakamura等[20]研究發現胚胎期及哺乳期暴露于BPA可導致小鼠體內多巴胺含量顯著升高；Matsuda等[21]也發現暴露于的BPA雄性小鼠海馬體及杏仁核部位的多巴胺含量升高。我們的基因定量結果表明，與5-羥色胺合成相關的基因tph1b和與多巴胺合成相關的基因th也都顯著升高，這可能是導致這2種神經遞質含量水平顯著升高的直接原因。

Nakamura等[22]的研究表明，BPA可能通過促進胚胎期小鼠神經元分化和遷移影響其新腦皮層的發育，我們猜測這可能是導致本研究中神經遞質含量升高的主要原因，因此進一步檢測了與神經系統早期發育相關的關鍵基因和蛋白的表達水平。Wnt1在中腦和后腦的神經特化過程中具有關鍵作用，它可以通過抑制b-catenin的降解調控shh基因表達，從而抑制神經發生[23]。我們的研究結果中，wnt1的基因轉錄水平顯著增加，而shha基因的轉錄水平顯著受到抑制，表明早期神經發育受到促進，與Nakamura等[22]的研究結果一致。Wnt1還可以通過lmx1a調控nr4a2，進而影響單胺類神經遞質神經元前體細胞的分化、成熟以及存活[24]。SYN2a是突觸形成的標志物，在突觸發生以及神經遞質釋放過程中均起到關鍵作用[25]。本研究中nr4a2和syn2a基因的轉錄水平也出現顯著性的升高，表明BPA可以通過促進早期神經發育而加速單胺類遞質神經元的分化。值得注意的是，與單胺類遞質神經元發育相關的lmx1a基因的轉錄水平僅在高濃度下顯著增加，而在低濃度組顯著降低。我們進一步檢測了LMX1A蛋白質含量，結果與基因表達水平相一致。同時SYN2a蛋白質含量僅在低濃度組顯著降低，在高濃度組沒有顯著變化。我們推測，在低濃度BPA暴露組幼魚體內觸發了某種保護機制，可以在某種程度上修復BPA引起的神經系統的影響，這也可以解釋在低濃度組幼魚行為變化不明顯的現象。

圖5 BPA暴露導致斑馬魚運動行為變化的作用機制示意圖Fig. 5 A diagram presenting possible mechanism of BPA-induced behavioral changes of larval zebrafish (Danio rerio)

綜上，本研究中BPA暴露可以促進斑馬魚胚胎早期神經發育及單胺類遞質神經元的分化，導致神經遞質含量的顯著性升高；在低濃度和高濃度BPA暴露條件下，可能分別通過5-羥色胺受體和多巴胺受體影響幼魚的運動行為，其作用機制總結如圖5。環境濃度下BPA暴露即可對斑馬魚的運行行為產生影響，提示BPA污染很可能對生態環境及人體健康產生潛在的危害。神經遞質對運動行為的調控機制以及在外源性污染物誘導神經毒性過程中的作用還需要進一步的深入研究。

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TheEffectsofBPAonNeurobehaviorandNeurotransmittersofLarvalZebrafish(Daniorerio)

Yang Lihua1, Shi Qipeng1, 2, Zhou Bingsheng1, *

1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170122001

2017-1-22錄用日期2017-3-8

1673-5897(2017)3-162-08

X171.5

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周炳升(1965-)，男，博士研究生導師，責任研究員，主要研究方向為環境毒理學，特別是有機污染物對水生生物作用的毒性效應、風險評價、健康危害及生態毒理學效應。

中國科學院戰略性先導科技專項(XDB140401)；中國科學院水生生物研究所特色研究所服務項目(Y55Z05)

楊麗華(1984-)，女，博士，副研究員，研究方向為環境毒理學，E-mail: lhyang@ihb.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: bszhou@ihb.ac.cn

楊麗華, 史奇朋, 周炳升. 雙酚A對斑馬魚幼魚神經遞質和神經行為的影響[J]. 生態毒理學報，2017, 12(3): 162-169

Yang L H, Shi Q P, Zhou B S. The effects of BPA on neurobehavior and neurotransmitters of larval zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 162-169 (in Chinese)