抗菌藥物亞抑菌濃度及其臨床意義

王方舟， 倪文濤， 崔俊昌

·綜述·

抗菌藥物亞抑菌濃度及其臨床意義

王方舟， 倪文濤， 崔俊昌

亞抑菌濃度； 最小選擇濃度； 細(xì)菌； 耐藥

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性越益嚴(yán)重，而新抗生素的研發(fā)速度卻在明顯下降[1-2]，這使得細(xì)菌耐藥，尤其是多重耐藥成為目前威脅人類健康嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。為了抑制細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生和發(fā)展，制定臨床合理的抗生素應(yīng)用策略，了解細(xì)菌耐藥產(chǎn)生機(jī)制就顯得尤為重要。隨著人們對細(xì)菌耐藥產(chǎn)生機(jī)制研究的進(jìn)展，臨床抗生素的應(yīng)用策略也在不斷改變，由基于最低抑菌濃度（MIC）的治療策略，發(fā)展為基于耐藥突變選擇窗（mutant selection window， MSW）理論的治療策略。近年來，有學(xué)者又提出了與細(xì)菌耐藥產(chǎn)生密切相關(guān)的亞抑菌濃度（subinhibitory concentration，Sub-MIC）和最小選擇濃度（minimal selective concentration，minSC）概念[3-4]，作為對MSW理論的補(bǔ)充，本文就相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 Sub-MIC

1.1 Sub-MIC和MIC的概念

Sub-MIC指低于MIC而對細(xì)菌有選擇作用的抗菌藥物濃度，表明藥物濃度低于MIC時(shí)細(xì)菌耐藥性仍可增強(qiáng)。Troy將野生型與耐藥突變型大腸埃希菌分別標(biāo)記，以1∶1的比例混合，置于含不同濃度的環(huán)丙沙星、鏈霉素及四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示抗菌藥物濃度較低時(shí)，野生菌株數(shù)量多于突變菌株；但隨著抗菌藥物濃度增高，突變菌株數(shù)量逐漸增加，原因?yàn)橥蛔兙陮Νh(huán)境的適應(yīng)性逐漸增加[5]。突變菌株與野生菌株數(shù)量相同時(shí)，兩者對環(huán)境適應(yīng)性相同，此時(shí)抗生素濃度被定義為minSC。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，minSC明顯低于與其對應(yīng)的MIC，minSC最高為MIC的1/4（抗鏈霉素rpsL105突變），最低僅為1/230（抗環(huán)丙沙星gyrASer83Leu突變）[6]。minSC是細(xì)菌產(chǎn)生的突變菌株可擴(kuò)增的最低藥物濃度，是Sub-MIC對細(xì)菌產(chǎn)生影響的閾值。當(dāng)抗菌藥物濃度低于minSC時(shí)，抗菌藥物對細(xì)菌無選擇作用；而高于minSC時(shí)，抗菌藥物可選擇性擴(kuò)增耐藥突變菌株。

1.2 Sub-MIC的理論依據(jù)

耐藥突變菌需要在菌群中成為優(yōu)勢菌才能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，不同環(huán)境中總是適應(yīng)性強(qiáng)的菌群占據(jù)優(yōu)勢。細(xì)菌通過自發(fā)遺傳突變和基因水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生不同的耐藥亞群（sub-population），不同亞群對環(huán)境有不同的適應(yīng)性[6]。細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥突變在提高耐藥性的同時(shí)通常會影響細(xì)胞正常功能，一般稱之為適應(yīng)性代價(jià)，因此，即使是高耐藥的突變菌，也無法在所有環(huán)境中都占據(jù)優(yōu)勢。如果某種基因型在菌群中所占數(shù)量增加，表明此基因型對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，反之則表明適應(yīng)性差。需要注意的是，菌群絕對數(shù)量的變化并不能準(zhǔn)確反映基因型的適應(yīng)性，例如菌群數(shù)量不斷減少，而此基因型所占的比例增加，表明這個(gè)基因型在此環(huán)境中仍有強(qiáng)適應(yīng)性[7]（圖1）。傳統(tǒng)MSW理論強(qiáng)調(diào)野生菌株對環(huán)境的適應(yīng)性，防突變濃度（MPC），為MSW上限，藥物濃度高于MPC時(shí)將會同時(shí)抑制野生菌株和耐藥菌株生長。MIC定義為MSW下限，此時(shí)野生菌株生長速度幾乎為零，突變菌株被選擇性擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)突變菌株在低于MIC時(shí)生長速度已經(jīng)高于野生菌株，表明突變菌株在低于MIC環(huán)境中適應(yīng)性強(qiáng)于野生菌株，MIC不適合作為判定藥物對細(xì)菌是否有選擇作用的分界點(diǎn)，應(yīng)選擇耐藥菌株與野生菌株的生長速度相同時(shí)藥物濃度，也就是minSC作為分界點(diǎn)，因?yàn)榇藭r(shí)耐藥菌株與野生菌株適應(yīng)性相同。

圖1 環(huán)境適應(yīng)性

Sub-MIC可增加細(xì)菌耐藥突變的頻率。自發(fā)突變是細(xì)菌獲得耐藥性的重要途徑，目前人們還無法阻止自發(fā)突變產(chǎn)生，但其發(fā)生率通常為10-6～10-8[8]。因此需要一定基數(shù)的細(xì)菌才能產(chǎn)生耐藥突變株。Sub-MIC下，氟喹諾酮類、氨基糖苷類及β內(nèi)酰胺類等藥物可通過啟動細(xì)菌SOS系統(tǒng)、增加氧自由基、干擾DNA表達(dá)等多種途徑增加細(xì)菌自發(fā)突變概率，最高可增至自然狀態(tài)下的15倍[9]。

不同濃度抗生素對細(xì)菌會產(chǎn)生不同的選擇作用。Sub-MIC下藥物對細(xì)菌的選擇作用需要克服適應(yīng)性代價(jià)才能選擇性擴(kuò)增耐藥株，因此更容易富集低適應(yīng)性代價(jià)突變，而不是高耐藥性突變菌株。Troy將20株野生型大腸埃希菌分別置于含Sub-MIC抗生素（1/4MIC鏈霉素，1/10MIC環(huán)丙沙星）的培養(yǎng)液中，連續(xù)培養(yǎng)并定期測定MIC。20株細(xì)菌在400代后對鏈霉素的MIC為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的8倍，14株菌600代后MIC增長了16倍。對環(huán)丙沙星的實(shí)驗(yàn)也有類似的結(jié)果[5-6]。這些結(jié)果證明Sub-MIC環(huán)境下，細(xì)菌可產(chǎn)生耐藥突變并選擇性擴(kuò)增低適應(yīng)性代價(jià)突變菌株，耐藥突變的適應(yīng)性代價(jià)越低，需要產(chǎn)生選擇壓力的抗菌藥物濃度越小，突變株越容易被選擇性擴(kuò)增。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存在代償性突變機(jī)制，細(xì)菌通過多次突變，可降低甚至完全消除耐藥突變的適應(yīng)性代價(jià)，使得突變菌在競爭中更有優(yōu)勢[10-11]。Sub-MIC藥物選擇出的低適應(yīng)性代價(jià)突變既可為低耐藥性，也可為高耐藥性。使得細(xì)菌可保留多種不同的耐藥突變，為進(jìn)一步耐藥突變的產(chǎn)生作準(zhǔn)備。

與Sub-MIC不同，MSW中抗菌藥物對細(xì)菌具有強(qiáng)選擇作用，細(xì)菌適應(yīng)性主要取決于耐藥性強(qiáng)弱，藥物快速清除敏感菌，并選擇性擴(kuò)增耐藥突變菌，在短時(shí)間內(nèi)細(xì)菌難以產(chǎn)生高耐藥性突變，因此MSW通常選擇性富集已存在的高耐藥性突變株。

隨著抗菌藥物在醫(yī)學(xué)、畜牧、種植業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用，藥物以原形或活性代謝產(chǎn)物形式排放，使得環(huán)境中存在微量濃度的抗菌藥物，極端情況下河水中的環(huán)丙沙星濃度可高達(dá)31 mg/L，超過抗感染治療患者的血藥濃度（約2～3 mg/L）[12-13]。自然界中大量致病菌與非致病菌長時(shí)間暴露于Sub-MIC環(huán)境中，增加了耐藥突變產(chǎn)生的可能性，使得環(huán)境中細(xì)菌成為耐藥基因的潛在來源。

2 Sub-MIC時(shí)耐藥產(chǎn)生的機(jī)制

Sub-MIC下更容易選擇性富集低適應(yīng)性代價(jià)的耐藥突變株。Gullberg等[14]和Sun等[15]認(rèn)為改變底物結(jié)構(gòu)、共同抵抗、改變形態(tài)及生物被膜等低適應(yīng)性代價(jià)突變可能為Sub-MIC時(shí)耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制，而產(chǎn)生外排泵、水解酶等高適應(yīng)性代價(jià)機(jī)制的可能性較小。Toprak等[16]通過morbidostat設(shè)備動態(tài)調(diào)節(jié)氯霉素、多西環(huán)素和甲氧芐啶3種藥物濃度，保持大腸埃希菌的生長速度衡定為50%最大生長速度。定期測量藥物的50%抑制濃度（IC50），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種藥物的IC50均明顯升高。氯霉素和多西環(huán)素IC50上升曲線平滑，結(jié)果顯示細(xì)菌的mar、acr、cmr等基因存在突變，其中任何一種基因突變均可使IC50增高，產(chǎn)生耐藥性對菌群數(shù)量要求低，IC50曲線較平滑。甲氧芐啶IC50升高曲線呈現(xiàn)明顯階段性。并且發(fā)現(xiàn)幾乎所有耐藥突變均位于DHFR基因，為g-9a或c-35t（DHFR表達(dá)增加相關(guān)），且突變按一定順序產(chǎn)生。因此需要細(xì)菌達(dá)到一定數(shù)量才能產(chǎn)生突變，致使IC50曲線呈階段性。以上結(jié)果表明Sub-MIC時(shí)細(xì)菌耐藥產(chǎn)生受細(xì)菌與藥物本身種類影響，細(xì)菌對不同抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的途徑不同，根本原因?yàn)楫a(chǎn)生的耐藥突變不同。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的耐藥性由其耐藥基因決定，Chevereau等[17]在研究大腸埃希菌對Sub- MIC呋喃妥因和氯霉素的IC50時(shí)發(fā)現(xiàn)，呋喃妥因的IC50在前10 d快速升高，而后增速明顯降低，基因檢測顯示細(xì)菌在呋喃妥因耐藥突變主要位點(diǎn)已產(chǎn)生突變，導(dǎo)致之后僅有少量耐藥突變產(chǎn)生。氯霉素的IC50持續(xù)升高，結(jié)果顯示細(xì)菌有多個(gè)位點(diǎn)可產(chǎn)生耐藥突變，各個(gè)突變隨機(jī)產(chǎn)生，在基因位點(diǎn)“消耗”完全之前，細(xì)菌耐藥性可持續(xù)升高。產(chǎn)生耐藥突變的位點(diǎn)及途徑越多，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥突變的“儲備”越多，有可能產(chǎn)生更高的耐藥性。見表1。

表1 Sub-MIC產(chǎn)生的耐藥突變

3 Sub-MIC的臨床意義

根據(jù)MSW理論，當(dāng)藥物濃度達(dá)到MPC以上時(shí)，敏感菌株及一步耐藥突變菌株的生長菌受到抑制，這時(shí)不會有耐藥突變菌株被選擇性富集，從而也不會產(chǎn)生耐藥[18]。但由于藥物在人體內(nèi)分布容積及藥物自身不良反應(yīng)影響，藥物濃度往往不能達(dá)到MPC以上，此時(shí)藥物濃度落入MSW中，耐藥菌選擇性富集，菌群產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗。藥物濃度下降至MIC以下時(shí)，細(xì)菌便處于Sub-MIC環(huán)境，藥物從選擇高耐藥性突變變?yōu)檫x擇低耐藥性代價(jià)突變（圖2）。此時(shí)細(xì)菌既可產(chǎn)生新的耐藥突變，也可擴(kuò)增原有耐藥突變菌，為產(chǎn)生更高耐藥性菌提供基礎(chǔ)。為盡量減少耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)增，學(xué)者認(rèn)為可以通過合理應(yīng)用抗菌藥物、聯(lián)合用藥、交替用藥等方式減少細(xì)菌在Sub-MIC下的暴露時(shí)間、減少耐藥突變產(chǎn)生，避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。

圖2 Sub-MIC和MSW

選用在感染部位濃度較高的藥物，提高感染部位的藥物濃度，盡量減少細(xì)菌暴露在Sub-MIC及MSW內(nèi)的時(shí)間，以及處于Sub-MIC下細(xì)菌的數(shù)量。如利奈唑胺較萬古霉素在肺泡上皮襯液及組織液中有較高的濃度[19]，治療肺部感染時(shí)可以快速清除細(xì)菌，減少暴露于Sub-MIC時(shí)間和細(xì)菌數(shù)量，從而減少耐藥突變的產(chǎn)生。

由于藥物在體內(nèi)分布濃度不同、高劑量藥物引起的不良反應(yīng)，以及長期應(yīng)用抗菌藥物導(dǎo)致菌群MIC/MPC升高，細(xì)菌難以避免會處于Sub-MIC環(huán)境。此時(shí)應(yīng)采用聯(lián)合用藥方式，一方面可以縮小或關(guān)閉MSW，減少耐藥菌株選擇性富集，另一方面可以減少Sub-MIC下新的耐藥突變的產(chǎn)生[20]。

實(shí)際臨床治療過程中，聯(lián)合用藥治療效果可能仍不理想，無法清除細(xì)菌、減少耐藥菌產(chǎn)生[21]。原因可能為藥物的相互作用受環(huán)境、細(xì)菌種類等多種因素影響，治療過程中細(xì)菌的耐藥性改變導(dǎo)致藥物相互作用改變，隨著耐藥性增強(qiáng)，藥物的協(xié)同作用不斷減弱。藥物對細(xì)菌的清除能力下降，菌群數(shù)量增加出現(xiàn)更多的耐藥突變，導(dǎo)致治療失敗。

4 不足和展望

目前對Sub-MIC與細(xì)菌耐藥的研究對象大多為大腸埃希菌，耐藥產(chǎn)生機(jī)制研究主要針對β 內(nèi)酰胺類、酰氨醇類、氨基糖苷類藥物，對當(dāng)前臨床應(yīng)用藥物如甘氨酰環(huán)素類、碳青霉烯類藥物缺少相關(guān)研究。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性基于抗菌藥物種類與細(xì)菌自身的基因，不同基因背景可能產(chǎn)生不同的耐藥突變。因此現(xiàn)有研究結(jié)果不能很好地預(yù)測其他細(xì)菌及藥物的耐藥產(chǎn)生機(jī)制[22-23]。

細(xì)菌除了通過自發(fā)突變的方式產(chǎn)生耐藥基因之外，水平基因轉(zhuǎn)移也是細(xì)菌獲得耐藥性的重要途徑，多重耐藥肺炎克雷伯菌可通過獲得耐藥質(zhì)粒產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥性[24]。革蘭陰性菌、革蘭陽性菌多通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式獲得β 內(nèi)酰胺水解酶耐藥基因，從而產(chǎn)生對β 內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性[25]，因此僅根據(jù)Sub-MIC時(shí)耐藥產(chǎn)生機(jī)制預(yù)測β 內(nèi)酰胺類耐藥性并不準(zhǔn)確。

Troy認(rèn)為Sub-MIC下細(xì)菌不僅可以產(chǎn)生新的耐藥突變，更重要的是已有的耐藥突變可以選擇性擴(kuò)增，這與MSW理論中耐藥突變菌僅在MSW內(nèi)富集不同。細(xì)菌的自發(fā)性突變總在發(fā)生，菌群中存在一定量的突變菌株，但如果這些突變菌株不被選擇性擴(kuò)增，成為優(yōu)勢菌，就可以被人體的免疫系統(tǒng)清除[6]。根據(jù)Sub-MIC理論，藥物對耐藥菌株產(chǎn)生選擇性擴(kuò)增作用的最低濃度是minSC，因此也有人將Sub-MIC看作是MSW理論的補(bǔ)充[26]。Sub-MIC耐藥機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度、耐藥性強(qiáng)弱各不相同，這是由細(xì)菌產(chǎn)生不同的耐藥突變基因決定的。Chevereau等[17]因此認(rèn)為，Sub-MIC理論可以幫助醫(yī)師在面對感染時(shí)，根據(jù)細(xì)菌及抗生素種類預(yù)測其耐藥性變化，采取更有針對性的治療。

隨著細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，Sub-MIC理論研究會更加深入，對動物或人體Sub-MIC的研究比體外研究更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，研究結(jié)果能更好地幫助解決細(xì)菌耐藥問題。

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Sub-inhibitory concentration of antimicrobial agents and its clinical implications

WANG Fangzhou, NI Wentao, CUI Junchang. （Department of Respiratory Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China）

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三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2016YW35），解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金項(xiàng)目（2014FC-TSYS- 2002）。

中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100853。

王方舟（1993—），男，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥的預(yù)防及抗感染藥物合理應(yīng)用。

崔俊昌，E-mail：cuijunchang@163.com。