微束X射線熒光和X射線吸收近邊結構譜分析云南某鉛鋅礦區苔蘚中鉛的分布和形態

宋玉芳 沈亞婷 ??

摘要苔蘚對重金屬脅迫具有良好耐受性和一定的積累能力。本研究采集并測定了鉛鋅礦區苔蘚和苔下土壤中重金屬元素含量，利用微束X射線熒光光譜（MicroXray fluorescence spectrometry， microXRF）測定了苔蘚中重金屬元素的分布，采用X射線吸收近邊結構（Xray absorption near edge structure， XANES）分析了苔蘚中Pb的元素形態。研究表明，礦區苔蘚具有較強的Pb、Zn、Cd、As積累能力，Pb和Zn最高含量可達1.06和1.23 mg/g， Cd和As最高含量可達30.5和13.2 μg/g。苔蘚地上部（尤其是新生組織）是苔蘚吸收并積累重金屬的主要部位；礦區采集的小灰蘚和匍枝青蘚中部分金屬元素分布規律不同，反應了不同苔蘚種屬對金屬元素的吸收、積累和耐受機制的差異。XANES結果顯示，Pb在小灰蘚中主要以Pb3（PO4）2形態存在（約78%），表明生成Pb3（PO4）2沉淀可能是苔蘚對Pb的耐受機制之一。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞苔蘚； 鉛鋅礦； 鉛； 植物修復； 微束X射線熒光； X射線吸收近邊結構； 微區分布； 形態

1引 言

重金屬污染是目前最嚴重的環境污染問題之一，礦山開采等人為活動一直是重金屬污染的重要來源。近年來隨著鉛鋅礦勘探、開采規模增加，全球由于采礦和冶煉活動排放到環境中的Pb高達6.35×105 噸/年。云南擁有我國最大的鉛鋅礦，且80%為露天礦石開采[1]，大量礦物顆粒隨著大氣飄塵進入礦區周圍環境中，成為礦區污染的重要來源之一。

露天開采的鉛鋅礦區大氣中通常存在大量富含Pb等重金屬的微細顆粒物[2]，可隨呼吸、消化等途徑進入人體，造成人體機能損傷。據報道，粒徑為0.1～1 μm的鉛塵在呼吸道中的沉降率約為35%，沉降后的14天內，高達90%以上的Pb可被吸收，通過呼吸道途徑和消化道途徑攝入的土壤和灰塵的鉛暴露量占總鉛暴露量的52.0%[3]。被人體攝取的Pb會對神經系統、血液系統、消化系統以及生殖系統造成損傷。

植物修復重金屬污染作為新興的綠色環保技術，具有經濟、生態友好等優勢。苔蘚特殊的細胞結構和獨特的元素吸收、存儲方式，使它能夠高效吸收大氣沉降和土壤中的重金屬[4]。首先，苔蘚葉片是單層細胞結構，葉表有尺寸為5～15 μm的不閉合孔狀結構，且無蠟質角質層覆蓋[5]，易于重金屬進入；其次，多毛分支結構使苔蘚的表面積與體積比約為維管植物的5～10倍，與環境接觸面積廣；此外，苔蘚根系僅在植物體末端起固著作用，苔蘚中營養物質及重金屬元素主要來源于葉表面對干濕大氣沉降物的吸收[6]，但也有報道苔蘚可從土壤等基質中吸收元素；最后，苔蘚具有對重金屬的耐受和積累能力，有研究發現苔蘚耐受并富集Pb的能力強，噴灑低濃度Pb2+溶液（0.2 mmol/L）進行短周期（7 d）脅迫，匍枝青蘚植株中Pb元素富集量高出對照組29倍，3.0 mmol/L Pb2+脅迫劑量脅迫28 d匍枝青蘚正常生長，且植株中Pb積累量高達2219 μg/g[7]。正因為苔蘚的以上生理結構等優勢，苔蘚具有很強的吸附保留重金屬的能力，可用于礦區大氣和土壤中重金屬的修復治理[8]。

目前，對Pb在苔蘚中的耐受和解毒機制的報道較少，有研究運用熒光顯微鏡觀察重金屬脅迫下的苔蘚微觀結構，發現毒性元素Pb主要積累在蘚類植物原絲體尖端的細胞壁增厚物中，并影響細胞壁成分的含量[9]，結合連續洗脫和超微結構觀察發現，儲存量僅占5%的胞內Pb元素對苔蘚生理生化影響最大[10]。

微束X射線熒光光譜分析技術可獲得微米級聚焦光斑，對植物樣品進行微區掃描后，可得到植物中主元素和微量元素的空間分布信息，利用同步輻射X射線吸收近邊精細結構可獲得元素的價態和化合物組成信息[11，12]。如將microXRF和XANES技術聯合應用于擬南芥幼苗中Pb的分布和根際土壤中Pb的形態特征，可以揭示擬南芥Pb中毒的主要原因[12]。

本研究通過測定鉛鋅礦區苔蘚及其苔下土壤中的重金屬含量，利用微束X射線熒光光譜儀測定苔蘚中Pb、Zn等元素的微區分布，同時使用XANES分析苔蘚中的Pb的存在形態，探討鉛鋅礦區苔蘚的重金屬積累能力和苔蘚中元素的分布儲存特征，揭示苔蘚對Pb的吸收和耐受機制。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

microXRF、XANES（上海光源BL14W1），7500a電感耦合等離子體質譜儀（ICPMS， Agilant公司），OES 8300電感耦合等離子體原子發射光譜儀（ICPAES， Perkin Elmer公司）。生物成分分析標準物質GSB6、GSB1、GSB7；土壤成分分析標準物質GBW07436、GBW07437、GBW07438。HNO3（BVⅢ），H2O2、 HCl、 HClO4、 HF均為優級純。XANES標樣：Pb3（PO4）2、PbO、Pb3O4、Pb（OH）2、C3H9ClPb、PbS、Pb5（PO4）3Cl、（C17H35COO）2Pb等購于阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2樣品采集與制備

2014年8月，在云南某鉛鋅礦區的礦堆、廢氣排放口、礦渣堆放點等位置設置典型采樣點，采集苔蘚及苔下土壤，用自封袋封裝，平鋪于工具箱內并避免疊壓，運回實驗室。

取新鮮苔蘚下土壤，冷凍干燥12 h后，挑出土壤中的雜物，研磨過200目尼龍篩，烘干至恒重。稱取0.0500 g土壤粉末樣，用HClHNO3HClO4HF四酸消解法消解，用于ICPAES分析。

將苔蘚用自來水反復沖洗多次，超聲振蕩30 s，去離子水沖洗3遍后，冷凍干燥12 h，用研缽研磨至均勻粉末狀，置于40℃烘箱內恒重12 h。稱取0.5000 g均勻粉末樣品， 用HNO3H2O2體系在聚四氟乙烯消解罐中消解后，用去離子水稀釋500倍，用于ICPMS分析。endprint

將清洗后的單株苔蘚鮮樣，粘在無硫膠帶上并固定于樣品托，用于microXRF分析。

將清洗后的小灰蘚樣品冷凍干燥后，用液氮輔助將具有完整葉、莖和假根的小灰蘚植株碾成粉末狀，在壓片機下壓成直徑10 mm，厚度0.8 mm圓片，用于苔蘚中Pb的L3邊XANES形態分析。

2.3樣品分析和質量控制

分別使用ICPAES和ICPMS測定土壤和植物樣品中的元素含量。分別使用GBW07404、GBW07405、GBW07406 3種土壤標樣和GSB6、GSB1、GSB7 3種植物標樣，設置3個重復樣及3組空白對照，對分析方法和整個分析流程進行質量監控，兩種方法回收率分別為94%～103%和80%～120%。

使用國家地質實驗測試中心自主研發的microXRF（圖1）觀察元素微區分布，采用聚束毛細管透鏡（Powerflux PF XBeam， Xray optical systems， inc. USA）對X射線進行聚焦，陽極靶材為銠靶，功率50 W，利用刀片測的實際焦斑大小為30 μm×30 μm，焦距4 mm。探測器為硅漂移探測器（Silicon drift detector， SDD），內置熱電制冷器制冷，室溫下在5.9 keV處分辨率為130 eV （譜峰半高寬， Full width high maximum， FWHM） （Vortex EX60 SDD， SII NanoTechnologh USA Inc）[14]。聚焦X射線光管和探測器呈45°放置于三維控制樣品臺上方，樣品放置在三維自控滑臺上，通過計算機控制滑臺驅動器使樣品移動，實現樣品的二維掃描。經銅箔進行microXRF能量刻度的標定和校正后，對樣品進行300 s單點采譜，確定各元素無干擾特征譜線，圈定微區分布分析時各元素感興趣區，通過預掃描確定樣品邊界后，進行精密掃描。激發電壓48 kV，電流0.8 mA，譜采集時間30 s，縱向步長50 μm、橫向步長25 μm。

在中國科學院上海應用物理研究所的同步輻射X射線吸收精細光束線（BL14W1）進行Pb的L3邊（13.035 keV）XANES測定。儲能環能量3.5 GeV，環電流120～200 mA，Si（111）雙平晶單色器，能量步長設置為0.5 eV，采譜范圍為

Symbolm@@ 80～200 eV，32元硅漂移固體探測器，用Pb箔校準能量。所有Pb標準化合物均經過碾磨后涂抹在熒光膠帶， 并用透射模式測定，待測樣品由于Pb含量較低，經過粉末壓片后用熒光模式測定。

2.4數據處理

采用Origin8.0，SPSS19.0繪制重金屬含量圖并進行相關性分析。使用PyMca軟件對X射線熒光譜圖進行能量矯正和背景扣除。使用Athena軟件進行XANES譜圖的能量校準、歸一化和線性擬合。

3結果與討論

3.1礦區苔蘚吸收和積累重金屬的能力及影響因素

苔下土壤中Pb和Zn平均含量分別為2.25和8.23 mg/g，As和Cd的平均值分別為0.216和0.121 mg/g，如圖2所示，研究區域土壤中Pb、Zn、As和Cd含量均超過了土壤環境質量三級標準。礦區苔蘚中Pb和Zn平均含量分別為0.268和0.506 mg/g，最高可達1.06和1.23 mg/g； Cd和As平均值為13.0和5.4 μg/g，最高可達30.5和13.2 μg/g（圖3）。可見苔蘚具有較強的重金屬吸收和積累能力。

對分別收集的7組苔蘚及根際土壤進行重金屬相關性分析（表1）， Cd和Zn的Pearson相關系數分別為0.84和0.82，顯著相關；As和Pb相關系數分別為0.52和0.39，中度相關。這表明苔蘚中Cd和Zn的主要來源可能是土壤，而As和Pb則可能是其它來源，如大氣沉降。對英國過去150年的苔蘚樣本進行元素濃度的主成分分析，發現大氣沉積是元素Pb和Cu的主要來源[15]。張元勛等[16]也發現苔蘚植株體內的Pb和Ni元素濃度和PM2.5大氣顆粒物中元素濃度存在很好的相關性。

3.2苔蘚中重金屬的分布

用microXRF測定元素分布之前，需要對樣品單點采譜，識別樣品中存在的元素，識別元素之間的干擾，獲取元素感興趣區。待測苔蘚樣品中，主要含有K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Pb等元素（圖4）。受X射線能量探測器分辨率的影響，K和Ca、Mn和Fe、Cu和Zn間的K

SymbolaA@ 和K

SymbolbA@ 間存在譜線重疊。其中，元素K的Kβ（3.59 keV）與元素Ca的Kα（3.69 keV）存在重疊干擾，分別選定元素K的Kα（3.31 keV）與元素Ca的Kα（3.69 keV）進行測定，感興趣分別圈定K（3.18～3.48 keV），Ca（3.56～3.95 keV）；元素Mn的Kβ（6.49 keV）與元素Fe的Kα（6.41 keV）存在重疊干擾，分別選定元素Mn的Kα（5.90 keV）與元素Fe的Kα（6.41keV）進行測定，感興趣分別圈定Mn （5.67～6.14 keV），Fe（6.16～6.74 keV）；元素Cu的Kβ（8.90 keV）與元素Zn的Kα（8.64 keV）存在重疊干擾，分別選定元素Cu的Kα（8.05 keV）與元素Zn的Kα（8.64keV）進行測定，感興趣分別圈定Cu （7.81～8.24 keV），Zn（8.28～9.01 keV）。由實測的苔蘚microXRF能譜圖（圖4）可見，K、Mn、Cu特征峰強度很弱，對Ca、Fe和Zn的重疊干擾較小，在元素分布特征的比較中貢獻率低，因此在對苔蘚進行microXRF分布掃描時，未予扣除。如果要進行濃度分布的比較，則應在建立校正曲線時，采用扣除背景和干擾的凈強度作為定量分析的基礎，并結合標準物質進行基體效應的校正。根據圈定的感興趣區，利用microXRF分別對具有完整葉、莖和假根的單根小灰蘚（圖5）和二岐分枝的匍枝青蘚分叉點以上部位進行微區掃描（圖6），獲得了苔蘚中的元素分布特征。endprint

從單根小灰蘚元素microXRF分布圖（圖7）可見，K、Ca、Fe、Mn、Pb、Zn等均積累在灰蘚中的新生綠色尖端部分，且呈由葉片邊緣向中肋分布明顯增加的趨勢，元素在櫛片中聚集。文獻[17]報道， 中肋表面突起狀組織櫛片是由厚壁細胞組成，苔蘚在PbCl2脅迫下具有將Pb2+隔離在該組織細胞壁的功能。圖7還表明，K、Ca和Pb在小灰蘚根部積累，但莖中分布較少。小灰蘚的元素分布特征表明， 地上部特別是新生組織可能是其儲存重金屬的主要部位，而Pb在小灰蘚根部的積累來源于根部吸收， 還是沉降吸收的向下輸送， 尚需進行深入探索。與小灰蘚不同，匍枝青蘚的元素分布（圖8）顯示，Cu、Zn主要積累于匍枝青蘚的二岐分枝葉基包裹主莖處，特別是端部；K、Mn、Fe、Pb主要積累于二岐分枝基部，K、Pb在主莖處也有部分分布。此外，由于K、Ca相互重疊，而K峰很弱、Ca峰很強，因此K、Ca的相關性不排除由于譜峰重疊對K產生了部分影響。

對比鉛鋅礦區小灰蘚和匍枝青蘚中的元素分布特征可以發現，Zn和Pb在兩種苔蘚中的分布特征一致，Zn主要位于新生組織的端部，Pb在兩種苔蘚的端部和基部均有積累；Fe、Mn的分布規律則完全相反，分別積累于端部和基部。分布規律異同，反映了不同苔蘚種屬對鉛鋅礦區金屬元素的吸收、積累、耐受機制的差異，值得進一步探索。

3.3Pb的形態分析

為進一步探索苔蘚吸收和耐受重金屬機制，需要開展Pb在苔蘚中形態特征研究。目前，對苔蘚中的Pb的儲存和解毒機理的報道有限，已有研究顯示，

形成PbS配體可能是小羽蘚的一種重要解毒機制，曹清晨等[18]采用XANES技術分析暴露

以胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽形態存在的低價態硫的總相對含量增加，間接說明含硫配體的絡合可能參與鉛的解毒機制。但是目前關于重金屬賦存形態在其它苔蘚種類解毒機制中發揮的作用尚未有報道。

利用XANES的譜圖經能量校準和歸一化后， 在

Symbolm@@ 20～70 eV內擬合，結果如圖9所示，Pb3（PO4）2和PbO分別占78%和22%（圖9），R因子為0.000032。數據表明，小灰蘚中Pb主要以Pb3（PO4）2的形式存在，這可能解釋了小灰蘚對Pb的積累和耐受原因。對于大多數植物，體內生成Pb3（PO4）2沉淀是常見的解毒機制之一。如有研究用XANES和透射電子顯微鏡能譜（Transmission electron microscopeenergy dispersive spectrometer， TEMEDX）分析技術證實Pb3（PO4）2是模式植物擬南芥、玉米和田菁中鉛的主要成分[19，20]。可見，生成Pb3（PO4）2沉淀可能也是苔蘚的一種解毒機制。

4結 論

本研究從化學分析和原位微區分析的角度，綜合運用ICPMS、ICPAES、microXRF和XANES等分析手段，開展了我國鉛鋅礦區苔蘚中重金屬元素含量、分布和形態特征研究，發現苔蘚樣品中Pb、Zn、Cd和As含量較高，部分樣品可高達1.06 mg/g （Pb）、1.23 mg/g （Zn）、30.5 μg/g （Cd）、13.2 μg/g （As），證實該地區生長的苔蘚具吸收和積累重金屬的能力。苔蘚的microXRF結果表明， 高濃度重金屬元素和植物營養元素主要積累在苔蘚地上部頂端部位，揭示葉端新生組織是苔蘚貯藏重金屬元素的主要部位。研究表明，灰蘚中的Pb主要以Pb3（PO4）2的形式存在，可能是灰蘚積累和耐受Pb等重金屬的原因之一。鑒于苔蘚種類多，對不同重金屬的吸收和積累機理可能存在差異，且影響其吸收的外界因素很多，所以在microXRF和XANES的基礎上，結合更多分析技術，如X射線熒光技術、X射線熒光微探針技術和微區顯微成像技術等，開展多種屬苔蘚組織細胞亞細胞水平的元素分布及毒性元素的賦存形態研究，可以為開展鉛鋅礦區苔蘚對土壤和大氣的植物修復提供進一步的理論支持。

致 謝衷心感謝中國地質科學院國家地質實驗測試中心羅立強、上海光源14W1線站黃宇營在微區測定及形態分析方面給予的指導和幫助；同時對曾遠、柳檢在實驗過程中給予的幫助表示衷心感謝。

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Distribution and Speciation of Lead in Moss Collected from a LeadZinc

Mining Area by MicroXRay Fluorescence and XRay Absorption

Near Edge Structure Analysis

SONG YuFang1，2， SHEN YaTing*1，3

1（National Research Center for Geoanalysis， Beijing 100037， China）

2（China University of Geosciences （Wuhan） Faculty of Materials Science and Chemistry， Wuhan 100083， China）

3（Key Laboratory of Ecological Geochemistry， Ministry of Land and Resources， Beijing 100037， China）

AbstractMoss has high tolerance and accumulating capacity to heavy metal. In this study， the distribution of heavy metal elements in moss sampled from leadzinc mine was analyzed by Xray fluorescence spectrometry. The speciation of lead was analyzed by Xray absorption nearedge spectroscopy. Research showed that the contents of Pb， Zn， Cd and As in the moss of the mining area were extremely high， and their maximum concentration were 1.06 mg/g ， 1.23 mg/g， 30.5 μg/g， 13.2 μg/g， respectively. Besides， the shoots especially the new tissue of the moss were the major sites for accumulation and storage of heavy metals. The microdistribution characteristics varied among Hypnum plumaeforme and Brachytheciumprocumbens， indicating the difference of different species of moss in absorption pathway， accumulation and tolerance mechanisms for heavy metal. Linear combination fitting results indicated that the main lead speciation in moss was lead phosphate （78%） and lead oxide （22%）， which suggested that the precipitation of lead phosphate might be the main mechanism of tolerance for moss.

KeywordsMoss； Leadzinc mine； Lead； Phytoremediation； MicroXray fluorescence； Xray absorption near edge structure； Microdistribution； Speciation

（Received 13 April 2017； accepted 12 June 2017）

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China （No. 2016YFC0600603）， the National High Technology Research and Development Program of China （No. 2007AA06Z124）， the China Geological Survey Projects（No.DD20160340） and the Fundamental Research Funds for the Chinese Academy of Geologecal Sciences （No.YYWF201620）endprint