GC—TOF MS結合化學計量學用于安化黑茶的識別

顏鴻飛 彭爭光 李蓉娟 陳 練 王美玲 付善良 戴 華 張 帆,4

(1. 湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2. 湖南省檢驗檢疫科學技術研究院，湖南 長沙 410100；3. 東港出入境檢驗檢疫局，遼寧 東港 118300； 4. 長沙環境保護職業技術學院，湖南 長沙 410004)

GC—TOF MS結合化學計量學用于安化黑茶的識別

顏鴻飛1,2彭爭光2李蓉娟3陳 練1,2王美玲1,2付善良1,2戴 華1張 帆2,4

(1. 湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004；2. 湖南省檢驗檢疫科學技術研究院，湖南 長沙 410100；3. 東港出入境檢驗檢疫局，遼寧 東港 118300； 4. 長沙環境保護職業技術學院，湖南 長沙 410004)

采用頂空固相微萃取聯合氣相色譜—飛行時間質譜(GC—TOF MS)對安化黑茶及其它產地黑茶中的揮發性成分進行檢測，對41種共有揮發性組分進行定性定量分析。應用化學計量學統計工具對數據進行變量篩選、主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，篩選出安化黑茶的26個顯著性差異香氣成分，通過主成分得分投影圖直觀反映樣本間的聚類趨勢和分類信息，對安化黑茶與不同產地黑茶樣品及其它種類茶葉進行有效區分和識別，找出14個對安化黑茶識別分類起著重要作用的揮發成分。結果表明，基于茶葉中揮發性成分差異的GC—TOF MS分析結合化學計量學統計方法用于安化黑茶識別是可行的。

頂空固相微萃取；氣相色譜—飛行時間質譜；主成分分析；偏最小二乘判別分析法；安化黑茶；識別

Abstract： The volatile components in Anhua and other dark teas were analyzed by headspace solid phase microextraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-time of flight mass spectrometry (GC-TOF MS). About 41 volatile compounds were analyzed qualitatively and quantitatively. A classification model and predict the authenticity obtained from variance analysis, principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminate analysis (PLSDA). In addition, the 26 compounds significant impacting on the classification were screened out from Anhua dark tea. The straight forward classification trend of Anhua dark tea and other samples was visualized through projection score plots obtained by PCA. Effective classification and identification of Anhua dark tea, other origin dark tea and other kinds were carried out. The 14 important components for classification were found. The results showed that the developed GC-TOF MS method combined with chemometrics based on the volatile components in tea could be used to discriminate Anhua dark tea.

Keywords： gas chromatography-time of flight-mass spectrometry (GC-TOF MS); principal component analysis (PCA); partial least squares discriminate analysis (PLSDA); volatile components; Anhua dark tea; discriminate

湖南安化黑茶的獨特品質和保健功能逐漸被人們所認同，成為國內外茶葉市場的新貴，深受廣大消費者青睞[1]。但黑茶生產門檻低，一直沒有完整的標準體系，導致市場上的安化黑茶品質良莠不齊。部分茶商用外路劣質茶葉加工成冒牌“安化黑茶”進行銷售，既損害了消費者的利益，也給安化黑茶質量和聲譽帶來了嚴重影響，在一定程度上阻礙了湖南黑茶產業的國際化進程。因此，有必要開發安化黑茶的識別表征技術，以保護安化產區黑茶獨特品質, 為安化黑茶的質量控制、品質量化及原產地保護提供一種科學的技術手段，促進湖南黑茶產業的持續健康發展[2]。

目前，茶葉鑒別方法主要為感官評定和簡單理化指標檢測方法，感官評定結果主觀性強，易受個體感官差異、主觀情緒、環境等因素的影響。同樣，常規理化指標檢測方法無法全面反映茶葉的整體特征，難以進行正確識別[3]。隨著高通量、高靈敏度、高分辨率的儀器分析技術的發展，為獲得茶葉的全組分信息提供了可能。但現代科學分析技術在對樣品進行多元分析的同時會產生大量的多參量高維數據，傳統分析化學數據處理方法難以對海量多維化學量測數據進行充分的信息提取、挖掘與利用。因此，利用現代分析儀器獲得樣品組分信息，再結合化學計量學統計分析工具來進行數據分析以最大程度獲取有用信息，在樣品成分信息差異、地域特征和品質特性之間建立起有效關聯，通過構建識別模式和特征標記物篩選方法，已經成為茶葉產地[4-5]、種類[6-7]、等級[8-9]的鑒別與分類研究的重要模式。已有一些研究者通過分析茶葉中香氣成分來進行分類[10-11]和識別的研究[12-13]，但尚未見運用HS—SPME技術萃取香氣物質結合化學計量學方法用于安化黑茶產地識別的研究報道。本研究采用自動頂空固相微萃取(HS—SPME)技術萃取安化黑茶的香氣物質，利用氣相色譜—飛行時間質譜聯用儀(GC—TOF MS)同時測定安化黑茶香氣全組分，采用方差分析篩選得到表征湖南安化黑茶香氣品質的特征成分，結合最常用的兩種化學計量學統計方法—主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)將GC—TOF MS原始數據進行降維、特征量提取和建立分類模型，區分安化黑茶與其它產地黑茶及其它類別茶葉，找出對安化黑茶識別分類起著重要作用的揮發成分，為安化黑茶的產地識別和質量監控提供了新的研究方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

安化黑茶：44個樣品，購自湖南安化縣茶廠；

其他茶葉：購自湖南茶葉市場，其中臧茶樣品4個，普洱茶樣品10個，烏龍茶樣品10個，紅茶樣品7個和綠茶樣品5個。

SPME萃取頭：2 cm，30/50 μm (DVB/CAR/PDMS) 型，美國色譜科公司。

1.2 試驗設備

氣相色譜—飛行時間質譜儀：Pegasus 4D型，美國力可公司；

樣品前處理多功能全自動進樣系統：Combi PAL型，瑞士思特斯公司；

分析天平：ML204型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取 參照文獻[14]，修改如下，稱取茶葉樣品2.0 g于25 mL固相微萃取瓶中，用帶聚四氟乙烯瓶墊的鉗口鋁蓋對萃取瓶進行封口密封，然后將萃取瓶置于樣品前處理多功能全自動進樣系統的樣品架上。樣品前處理多功能全自動進樣系統操作步驟：首先將萃取瓶放入加熱孔中80 ℃恒溫振蕩平衡20 min后，插入固相微萃取針，伸出萃取纖維頭，在600 r/min攪拌下進行頂空萃取1 h。固相微萃取吸附完成后，取出立即插入色譜進樣口，溫度250 ℃下解吸附5 min，同時觸發氣相色譜—飛行時間質譜儀進行數據采集。固相微萃取頭在下次使用前需在氣相色譜進樣口280 ℃下加熱老化至少1 h。

1.3.2 GC—TOF MS分析 色譜柱：Rtx-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；分析條件：參照文獻[14]。

1.4 定性和定量方法

1.4.1 定性分析 由GC—TOF MS分析得到的質譜數據經工作站ChromaTOF軟件與NIST 11 LIB標準譜庫自動進行識別和匹配檢索，僅選出匹配度≥80%的峰物質，生成質譜峰列表數據，再進一步結合分子量、結構式、質譜圖等信息及有關文獻報道來確定各出峰物質的成分。

1.4.2 定量分析 通過色譜工作站對總離子色譜圖進行自動積分和峰面積計算，然后通過人工核對色譜峰積分效果仔細核對。若有積分不準確的情況，應修改積分參數后重新自動積分，以避免積分重復和不合理情況或者通過手工積分的方式取得各揮發性成分的可靠含量。設定積分閾值使相對含量<0.01%的峰不進行積分計算。相對峰面積采用峰面積歸一化法進行計算，得到各物質組分的相對百分比含量。

1.5 數據處理方法

運用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5 軟件進行數據的變量篩選、主成分分析和偏最小二乘判別分析等統計分析。

2 結果與分析

2.1 安化黑茶香氣成分特征分析

HS—SPME萃取香氣化合物后，經GC—TOF MS檢測，采用ChromaTOF軟件按1.4標準進行篩選,篩選得到的黑茶樣品41個共有組分見表l。其中，3,5-辛二烯-2-酮(E,E)、反,反-2,4-庚二烯醛、和6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮等烯類化合物是形成安化黑茶獨特發酵香味“菌花香”的重要物質成分[15]。2-戊基呋喃、香葉基丙酮等對安化茯磚茶具有獨特烘焙香或火功香味有重要貢獻[16]。為找出安化黑茶的特征香氣成分，根據黑茶樣品的產地來源將茶樣中安化黑茶歸為一類，其它產地黑茶歸為另一類。以不同茶葉中的41個共有香氣物質相對含量為變量，進行方差分析見表1，安化黑茶與非安化黑茶主要的差異性成分為：2,6,10-三甲基十二烷、2-戊基呋喃、alpha-松油醇、反2-(2-戊基)呋喃、β-紫羅酮、1,2,3-三甲氧基苯、3,5-辛二烯-2-酮(E,E)、甲基庚烯酮、2,6,6-三甲基-1-環己烯-1-羧醛、反,反-2,4-庚二烯醛、香葉基丙酮、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、苯乙酮、7,9-二叔丁基-1-氧雜螺(4 ,5)癸-6,9-二烯-2,8-二酮、藜蘆醚、2-甲基十七烷、2,6,6-三甲基-2-環己烯-1,4-二酮、α-姜黃烯、2,3,5,8-四甲基癸烷、苯甲醛、藏花醛、2,3,5,6-四甲基吡嗪、紫羅烯、1,3-二叔丁基苯、3,7-二甲基-1,3,7-辛三烯。這些差異性香氣成分共同構成了湖南安化黑茶獨特的香氣品質特征。

2.2 主成分分析

方差分析只能對兩大類型茶樣香氣成分差異的總體情況進行評估，無法對各香氣成分在各茶葉樣品的分布規律及特征進行比較分析，為此需要進一步進行多變量分析處理。主成分分析作為最常用的多元統計方法可將高維數據投影到較低維空間，用較少的綜合指標反映原始指標從而解析出主要影響因素，還可根據主成分得分圖分析各類樣本的分布規律用于品種分類[17]、產地溯源[18]和品質分級[19]等研究。本試驗以安化黑茶的26個顯著性差異香氣成分的峰面積相對百分比作為變量，建立數據矩陣，運用SIMCA P 11.5進行PCA分析，安化黑茶和其它產地黑茶樣品在第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)上的主成分得分投影圖(圖1)，能夠直觀地反映樣本間的相似或差異性。由圖1可知，安化黑茶和其它產地黑茶樣品二維空間中的分布呈現出一定程度的類別聚集趨勢，但分布較為分散,存在部分樣品相互交叉重疊，兩個類別樣品并沒有完全分離，識別效果不太理想。由表2可知，主成分的特征值大于1的有8個，但累積貢獻率不足80%，前3個主成分的累積方差貢獻率為50.492%，這可能使得主成分分析方法在本應用中存在信息量提取不足、特征向量方向不確定等問題，難以實現對安化黑茶、其它產地黑茶的有效區分。

表1 安化黑茶的共有香氣物質

2.3 偏最小二乘判別分析

偏最小二乘法判別分析法作為一種新型的多元統計數據分析方法，具有主成分分析、典型相關分析和多元回歸分析等多種功能，可以消除相互重疊的數據信息，尤其是當自變量個數大于觀察量個數時，其數據分析結果更加準確可靠。為尋找更為有效的安化黑茶識別分析方法，本研究嘗試利用PLS—DA的分析方法進行判別分析。PLS-DA分析同樣將安化黑茶的26個顯著性差異香氣成分的相對峰面積百分比作為變量，建立數據矩陣，根據已知的茶葉信息將樣本預先分為3個類別即類別1(安化黑茶)、類別2(其它產地黑茶)和類別3(其它類別茶葉包括綠茶、紅茶、烏龍茶)，進行偏最小二乘法判別分析，所得OPLS-DA圖，見圖2。通過每個樣本點在PLS-DA得分圖上的相對位置和分布情況來顯示樣本的分類信息，從而達到樣品識別的目的。圖2(a)直觀顯示了安化黑茶與其它產地黑茶較為集中地分布在各自特征區域，基本可以將所有樣本分為兩組,基本以PC1=-2為界顯著分開，兩個類別的茶葉基本分離，實現對安化產地黑茶與其它產地黑茶的較好識別。同樣使用該方法對類別1(安化黑茶)、類別3(其它類別茶葉)進行了識別分析[見圖3(b)]，發現兩類茶葉樣本完全分離，類別聚集更加明顯，可以將所有樣本分為兩組，基本以PC1=-1為界顯著分開，表明第一個主成分對于區分這兩個類別茶葉起了主要的區分作用。此外，還運用該模型同時對3類茶葉進行了識別分析[見圖2(c)]，從樣品點的分布趨勢來看，3個類別的茶葉相對集中地聚集在各自獨立的特征區域, 呈現出較好的類聚效應，可以將所有樣本分為3個組別，各組別分布區域界限較明顯。以PC1=0為界明顯分開，類別1集中分布在PC1>0的區域，類別2和類別3集中分布在PC1<0的區域，第一個主成分起了主要的區分作用。另外，類別3與另外兩個類別茶葉也存在一定的分布特征區域，有較好的分離效果。基本上以PC2=1為界明顯區分開來，類別1和類別2)較為集中分布在PC2<1的區域，類別3較為集中分布在PC2>1的區域，說明第二個主成分起了主要的區分作用。所以只要將未知樣品經上述方法處理得到其投影得分值及模型空間內的分布區域和位置，就可對其種類進行識別。以上結果表明，本研究采用OPLS-DA的分類識別效果明顯優于主成分分析結果，可用于安化黑茶的產地識別及分類。

表2 主成分的方差貢獻率

圖1 黑茶樣品的主成分得分投影圖

圖2 茶葉樣品OPLS-DA分析結果圖

2.4 成分變量重要性分析

進一步運用PLS-DA對類別1(安化黑茶)、類別2(其它產地黑茶)兩類樣本進行變量重要性評分，分析計算出PLS-DA變量重要性因子(Variable important for the projection，VIP)分值，可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，VIP 值越大，變量在兩個類別中的差異越顯著，得到VIP值>1的理化成分有14個，按照分值大小順序依次為2,6,10-三甲基十二烷、alpha-松油醇、2-戊基呋喃、β-紫羅酮、反2-(2-戊基)呋喃、1,2,3-三甲氧基苯、甲基庚烯酮、3,5 - 辛二烯-2-酮(E,E)、香葉基丙酮、2,6,6-三甲基-1-環己烯-1-羧醛、反,反-2,4-庚二烯醛、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、2,3,5,8-四甲基癸烷和2,3,5,6-四甲基吡嗪。

3 結論

采用頂空固相微萃取結合GC—TOF MS分析茶葉中揮發性成分，利用主成分分析法與偏最小二乘判別法實現了不同茶葉的識別區分，獲得了對分類判別貢獻較大的14個揮發性成分。結果表明，基于茶葉中揮發性成分差異的GC—TOF MS分析結合化學計量學統計方法用于湖南安化黑茶識別是可行的。篩選出的差異性揮發性成分在安化黑茶中的分布規律及擴展該分析方法的應用領域有待進一步分析和研究。

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Discrimination of Anhua dark tea by gas chromatography-time of flight mass spectrometry combined with chemometrics

YAN Hong-fei1,2PENGZheng-guang2LIRong-juan3CHENLian1,2WANGMei-Ling1,2FUShan-liang1,2DAIHua1ZHANGFan2,4

(1.HunanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Changsha,Hunan410004,China; 2.HunanAcademyofScienceandTechnologyforInspectionandQuarantine,Changsha,Hunan410004,China; 3.DonggangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Donggang,Liaoning118300,China;
4.ChangshaEnvironmentalProtectionCollege,Changsha,Hunan410004,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.009

湖南省科技計劃項目(編號：2015JC328)；糧油深加工與品質控制湖南省2011協同創新項目資助(編號：湘教通[2013]448號)

顏鴻飛，男，湖南出入境檢驗檢疫局高級工程師，碩士。

張帆(1985—)，女，長沙環境保護職業技術學院副教授，博士。E-mail：amily9281@163.com

2017—05—08