高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷動物模型制備的實驗研究

徐曉峰，許秀娟，郝 建，吳 升，李樹雯，錢 鈞，常月進 ，劉 娟，王麗君，姚 遠

·論 著·

高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷動物模型制備的實驗研究

徐曉峰1，許秀娟1，郝 建1，吳 升1，李樹雯1，錢 鈞1，常月進1，劉 娟1，王麗君1，姚 遠2

目的制備高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷(ALI)動物模型。方法選擇20只雄性豚鼠隨機分為2組，每組10只，其中健康豚鼠為對照組、急性肺損傷豚鼠為實驗組。實驗組吸入150 ℃高溫氣體制作豚鼠ALI動物模型，然后處死2組豚鼠并取豚鼠右肺的大體標本，稱重計算豚鼠肺濕/干重比(W/D)，選取2組豚鼠左上肺組織進行HE染色，利用光學顯微鏡觀察肺組織病理變化情況，及時記錄其病理變化的結果；對豚鼠動脈血液進行血氣分析并比較。結果實驗組豚鼠肺組織病理結構呈現明顯的急性炎癥性改變;實驗組豚鼠肺W/D比值顯著高于對照組[(5.72±0.31)vs(4.88±0.11),P<0.05];實驗組豚鼠pH、PaO2顯著低于對照組[(7.02±0.12)vs(7.38±0.04)，(98.80±62.60)mmHgvs(177.30±24.70)mmHg，P<0.05]，而PaCO2顯著高于對照組[(74.70±23.23)mmHgvs(31.10±8.77)mmHg，P<0.05]。結論成功制作豚鼠ALI實驗動物模型。該模型達到ALI要求，仿真性能高、重復性好、穩定性高，為今后研究高溫氣體吸入致ALI的臨床及基礎研究提供了可靠的動物模型。

實驗動物模型；急性肺損傷；豚鼠

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是各種肺內外致病因素導致的急性彌漫性炎癥性肺損傷，如進一步惡化，則表現為急性呼吸窘迫綜合征，引起急性呼吸衰竭。以往研究ALI發生和發展的大部分信息是從尸檢肺及肺組織活檢中得到，為進一步了解肺損傷階段性的實況及全景，ALI動物模型的研究發揮了重要作用[1-2]。目前有機械通氣、脂多糖注射、細菌感染、高氧、油酸、鹽酸吸入等ALI的造模方法，然而大部分動物模型都有其局限性?，F代戰爭常使用火焰噴射器或者各種燃燒物質作為武器，導致人體ALI非常常見。本研究制備高溫氣體吸入致豚鼠ALI動物模型模擬野戰狀態火器傷，以期為今后研究高溫氣體吸入致ALI的病理、病理生理、機制、治療等提供可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要材料 健康雄性豚鼠20只,體重(203±19)g，購于安徽醫科大學附屬省立醫院動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK(皖)2006-002]。動物實驗前，在20～29 ℃的室內(保持新鮮空氣)適應性喂養1～2 d，自由飲食飲水。高溫氣體實驗平臺由中國科技大學火災科學國家重點實驗室設計制作。動脈血氣分析儀(GEM Premier 3000，凱隆國際實業有限公司生產)。

1.2實驗模型裝置設計 與中國科技大學火災科學國家重點實驗室聯合研制高溫氣體動物實驗模型裝置，見圖1、圖2、圖3。實驗模型裝置由三大部組成：第一部分為艙室結構裝置，第二部分為進氣口和出氣口裝置，第三部分為實驗模型底部點火啟動或關閉滅火的控制開關。該調控實驗模型裝置輸入電壓：220～380 V，輸出電流：0～20 A，輸出功率：0～5 kW，調節可變的溫度數值在0～200 ℃范圍。

圖1高溫氣體實驗裝置三維圖

圖2高溫氣體實驗裝置平面圖

圖3高溫氣體實驗裝置正面平面圖

1.3ALI動物模型制作 將健康雄性豚鼠20只隨機分為2組，其中10只健康豚鼠為對照組、10只急性肺損傷豚鼠為實驗組。將2組稱重并記錄,用400 mg/kg的10%水合氯醛注射液注入實驗豚鼠的腹腔中進行麻醉，麻醉完畢后，放置在實驗裝置內平臺中，啟動點火，調節實驗模型裝置內可變溫度至150 ℃高溫氣體供給豚鼠吸入，整個ALI的實驗時間控制在3 min，豚鼠ALI的實驗結束時，迅速調節實驗裝置內氣體高溫度至常溫狀態。

1.4實驗樣品測定 造模成功后觀察豚鼠4 h，用10%水合氯醛對2組豚鼠進行麻醉，打開胸腹腔，經腹主動脈抽取4 mL血液進行動脈血氣分析。提取2組豚鼠的右肺組織，在標準濾紙上吸干表面液體后，稱取濕重，放入鼓風恒溫干燥箱100 ℃干燥48 h，待完全干燥后，稱取干重，計算W/D比值。另取豚鼠左上肺組織，10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片，HE染色行病理組織學檢查。

2 結 果

2.1病理學檢查結果 對照組顯示正常健康豚鼠的肺解剖組織，實驗組可見肺泡壁斷裂破壞顯著、肺泡腔融合變大，肺間質增寬、結構損傷、破壞，肺毛細胞血管顯明充血、水腫和大量的炎性細胞浸潤。見圖4。

a:對照組;b:實驗組

圖4豚鼠肺組織光學顯微鏡下病理學變化

2.2W/D和動脈血氣分析結果 實驗組豚鼠肺W/D比值顯著高于對照組(P<0.05)，提示ALI豚鼠肺組織積聚大量的水分，其肺的體積重量明顯增加。2組豚鼠動脈血氣分析比較，實驗組豚鼠pH、PaO2顯著低于對照組(P<0.05)，而PaCO2顯著高于對照組(P<0.05)，提示高溫對肺組織破壞比較嚴重，瞬間引起小氣道的灼傷、肺泡廣泛斷裂、肺間質明顯水腫，引起急性的嚴重氣體交換功能障礙，導致豚鼠出現氧分壓下降明顯并伴有高碳酸血癥。見表1。

組別n濕/干重比pHPaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)對照組10488±011738±00417730±24703110±877實驗組10572±031?702±012?9880±6260?7470±2323?與對照組比較，?P<005；1mmHg=0133kPa

3 討 論

在現代戰爭中常使用火焰噴射器或者各種原因火災燃燒物質，導致瞬間釋放大量高溫熱能量，使周圍環境空氣溫度迅速上升，當人體吸入高溫熱能的空氣可造成氣道損傷，導致ALI。本實驗著重模擬火焰噴射器或火災引起的高溫氣體給予豚鼠吸入，使用實驗設計的裝置制作成ALI動物模型進行實驗研究。根據消防性能化設計指導原則[3]，人體對煙氣層等火災環境的輻射熱的耐受極限為2.5 kW/m2，即相當于上部煙氣層的溫度約為180～200 ℃。當熱輻射強度<2.5 kW/m2，人的耐受時間>5 min；當熱輻射強度>2.5 kW/m2，人的耐受時間<30 s。另外，根據高溫環境下人員極限忍耐時間和溫度之間的關系(Crane公式) 表示為：tc(T)﹦3.28×108/T3.61，其中T為環境的溫度，單位為攝氏度；tc(T)的單位為min，據此理論[3]，對本實驗設計裝置進行研究改良，設置高溫氣體調控溫度在150 ℃左右，時間設定3 min，制作豚鼠ALI動物模型。經過本設計的設備裝置實驗研究顯示，可達到ALI實驗動物模型的要求，仿真性能高、重復性好、穩定性高。

評價一個動物模型是否合格主要取決于它是否能較好地模擬該疾病的發生、發展過程，包括組織病理學和生理學變化。ALI的主要病理學特征表現為上皮細胞損傷、中性粒細胞等炎性細胞浸潤和滲透性肺水腫的形成[4-5]。實驗設備裝置能否成功制作出ALI實驗動物模型，取決于肺解剖病理學結構破壞程度[6-7]、肺水腫[8-9]和是否有呼吸衰竭情況[10-11]。本研究的實驗裝置模擬野戰狀態火器傷，直接對細胞組織產生損害及破壞作用，造成肺泡斷裂破壞、肺毛細血管明顯充血水腫，肺間質組織可見炎性細胞浸泡等，從圖4病理學結果顯示，實驗組豚鼠肺解剖結構與對照組比較遭受明顯破壞，病理學檢查可見肺泡壁明顯的斷裂、破壞，肺泡融合變大，肺間質增寬、破壞、結構紊亂，肺毛細胞血管顯明充血、水腫和大量炎性細胞浸潤。由此證明，上述高溫氣體實驗裝置，啟動開關點火，引發的高溫氣體致豚鼠吸入后，造成豚鼠發生ALI，使得肺解剖結構遭受明顯的嚴重而廣泛破壞，與之前的文獻報道一致[6,10,12-13]。從本研究實驗組豚鼠肺W/D比值明顯比對照組增加(P<0.05)，提示豚鼠伴有ALI后，肺組織間質滲出液顯著積聚，引起肺體積增大、重量增加，證明實驗組有明顯的肺水腫，肺水腫引起肺體積重量顯著增加，造成肺組織的順應性明顯下降，與劉娟等[14]的報道一致。ALI早期引起過度換氣，代償中氧分壓并不降低，且因肺組織廣泛破壞而出現PaCO2升高。本研究PaCO2的檢測是在造模4 h后抽取豚鼠動脈血進行血氣分析，與對照組比較，實驗組動脈血氣分析pH值、動脈血PaO2均顯著下降(均P<0.05)，且PaCO2明顯升高(P<0.05)，揭示本實驗的火器高溫瞬間對肺組織破壞比較嚴重，瞬間引起小氣道灼傷、肺泡廣泛斷裂、肺間質明顯水腫，引起急性的嚴重氣體交換功能障礙，導致豚鼠呈單純性高碳酸血癥合并重度呼吸性酸中毒，與之前的文獻報道一致[14-17]。

綜上所述，應用本項目研制的高溫氣體給豚鼠吸入，成功制作出實驗動物ALI模型的結論有：①觀察豚鼠的肺W/D比值明顯增加，提示肺水腫。②測量豚鼠的動脈血氣顯示：pH值下降伴PaCO2明顯升高，提示單純性高碳酸血癥導致呼吸性酸中毒。③肺組織解剖結構損傷、破壞，病理學檢查觀察肺組織體積顯著變大、肺泡斷裂、融合氣腔擴大、肺毛細胞血管顯明充血水腫、大量的炎性細胞浸潤以及肺間質增寬、結構損傷、破壞等變化情況。本研究的難點在模擬火焰噴射器或火災引起的ALI動物模型的建立。在模擬火器傷的過程中，對于溫度和爆破時間的要求都很高，因為一旦溫度過高，時間過長，會造成受試豚鼠其他部位的燒傷；而若溫度和時間不夠，則不能完成模擬ALI的生理病理過程。本研究的高溫氣體實驗裝置，設計了計算機集成模塊自動調控整個結構裝置內的空間輻射增熱源和可變輸出功率，調控實驗模型裝置內的空氣流動、溫度的變化，可以調控高溫氣體溫度、時間和高溫氣體流動，模擬火焰噴射器或火災引起的高溫氣體給予豚鼠吸入，能很好地制作出ALI實驗動物模型的效果，仿真性能高、重復性好、穩定性高，對戰爭及突發公共衛生事件中高溫氣體吸入體內致ALI的臨床及基礎研究提供了很好的保證。

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Anexperimentalstudyofacutelunginjuryinguineapigsinducedbyhightemperaturegas

XU Xiao-feng1, XU Xiu-juan1, HAO Jian1,WU Sheng1, LI Shu-wen1, QIAN Jun1, CHANG Yue-jin1, LIU Juan1, WANG Li-jun1, YAO Yuan2

(1.CardiopulmonaryRehabilitationMedicineCentre,HangzhouSanatoriumofNanjingMilitaryRegion,Hangzhou310007,Zhejiang,China；2.DepartmentofEmergency,the117thHospitalofPLA,Hangzhou310034,Zhejiang,China)

AbstractObjectiveTo prepare the experimental animal models of acute lung injury (ALI) induced by high temperature gas inhalation in guinea pigs.MethodsTwenty male guinea pigs were randomly divided into 2 groups, each group of 10 guinea pigs. The healthy guinea pigs were set as the control group, and the ALI guinea pigs were set as the experimental group. High temperature gas (150 ℃) was given to the guinea pigs of the experimental group for inhaling 5 minutes to induce the animal model of ALI. Then the two groups of guinea pigs were executed and lung specimens were taken from guinea pigs. Wet/dry weight ratio (W/D) of the right lungs was calculated. Up-left lungs of the two groups were stained with HE, and the pathological changes of lung tissues were observe by optical microscope in the two groups; The blood gas of the guinea pigs arterial blood was also analyzed and compared.ResultsThe pathological structure of lung tissue of the experimental group showed obvious acute inflammatory changes. The lung W/D ratio of guinea pigs inthe experimental group was significantly higher than that in the control group [(5.72±0.31)vs(4.88±0.11),P<0.05]. The pH and PaO2of guinea pigs in the experimental group were significantly lower than those in the control group[(7.02±0.12)vs(7.38±0.04)，(98.80±62.60)mmHgvs(177.30±24.70)mmHg，P<0.05], while PaCO2was significantly higher than that in the control group [(74.70±23.23)mmHgvs(31.10±8.77)mmHg，P<0.05].ConclusionThe high temperature gas supplied to guinea pigs designed in this study can successfully establish ALI experimental animal model which meets the requirement of ALI and has high simulation performance, good repeatability, high stability.It provides a reliable animal model for the clinical and basic research of ALI induced by high temperature gas inhalation.

Experimental animal model；Acute lung injury；Guinea pig

R563.8

A

1672-271X(2017)05-0449-04

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.05.001

2017-03-22;

2017-07-05)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

全軍醫藥衛生科研基金(10Z034)

1.310007 杭州, 南京軍區杭州療養院心肺康復醫學中心；2.310034 杭州, 解放軍第117醫院急診科

郝 建，E-mail：jianhaol05@163.com

徐曉峰，許秀娟，郝 建,等.高溫氣體吸入致豚鼠急性肺損傷動物模型制備的實驗研究[J].東南國防醫藥，2017,19(5):449-452.