相關炎癥因子在聲帶黏膜損傷中的作用

王華濤，張 勇，王志頤，江滿杰，吳明海，潘 晗，程 友 ，陳 偉

·論 著·

相關炎癥因子在聲帶黏膜損傷中的作用

王華濤1，張 勇2，王志頤2，江滿杰2，吳明海2，潘 晗2，程 友2，陳 偉2

目的通過觀察相關炎癥因子在不同程度炎癥聲帶黏膜表達的差異，探討其對聲帶黏膜屏障損傷的作用。方法將26例確診伴有咽喉反流(LPR)的聲帶白斑且擬行手術治療的患者隨機分為質子泵抑制劑(PPI)組(口服艾司奧美拉唑鎂腸溶片)和對照組(口服胃黏膜保護劑)，每組13例，分別采集手術中及術后8周的聲帶黏膜標本。用HE染色對聲帶炎癥的病理改變進行評分比較；ELISA法測定炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6在不同程度炎癥黏膜的表達水平。所有患者每月定期復查，隨訪時間至少為12個月。結果術后12個月隨訪，對照組和PPI組累計復發率分別為84.6%和38.5%，累計復發率差異有統計學意義(P<0.05)。PPI組術后8周聲帶黏膜炎癥病理評分均值較術中黏膜評分明顯降低(P<0.01)；對照組術中聲帶黏膜炎癥病理評分均值與術后8周評分均值相比，差異無統計學意義(P>0.05)。ELISA檢測顯示，PPI組術后8周聲帶黏膜IL-1β、TNF-α、IL-6表達與術中比較顯著下調(P<0.01)；而對照組術中及術后8周聲帶黏膜IL-1β、TNF-α、IL-6表達差異無統計學意義(P>0.05)。結論咽喉反流物刺激聲帶黏膜的炎癥反應可能是聲帶黏膜損傷的重要機制。

聲帶白斑；咽喉反流；炎癥；炎癥因子

AbstractObjectiveTo study the roles of related inflammatory factors in vocal cord mucosal barrier damage via probing the differential expression of these factors in vocal cord mucosa with inflammation of different degrees.MethodsTwenty-six patients suffering from vocal leukoplakia accompanied with laryngopharyngeal reflux (LPR) were randomly divided into groups with or without oral administration of proton pump inhibitor (PPI), 13 cases in each group. Mucosal specimens of vocal cord were collected from all the patients during operation and at 8 weeks after operation. HE staining was used to score the pathological changes of the mucosa. ELISA was utilized to detect the levels of inflammatory factors including TNF-α, IL-1 and IL-6.ResultsThe accumulated recurrence rates at 12 months after operation of PPI-treated group and the control group were 38.5% and 84.6% respectively, and the difference was statistically significant (P<0.05). In the the control group, the average inflammation score evaluated by HE staining in specimens obtained 8 weeks after operation was significantly lower than those obtained during operation, and the difference was statistically significant (P<0.01). In the control group, the difference was statistically insignificant (P>0.05). As for IL-1β, TNF-α and IL-6, their expression in the specimens of 8 weeks after operation in the PPI-treated group were down-regulated when com-

pared with those in the specimens obtained during operation (allP<0.05), while their differences in the control group were statistically insignificant (allP>0.05).ConclusionThe possible mechanism of vocal mucosal barrier damage in vocal leukoplakia accompanied with LPR maybe the vocal mucosal inflammation induced by refluxed materials. [Keywords] Vocal leukoplakia; Laryngopharyngeal reflux; Inflammation; Inflammatory factor

既往研究發現，咽喉反流(laryngopharyngeal reflux, LPR)加重聲帶黏膜的慢性炎癥狀態，抑酸治療在治療LPR的同時可以明顯改善聲帶白斑的預后，減少聲帶白斑的復發[1]；但對于抑酸治療改善聲帶白斑發展的作用途徑仍不清楚，缺少內在機制方面的研究[2]。為此，本研究通過觀察相關炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)在不同程度炎癥聲帶黏膜表達的差異，探討相關炎癥因子介導的炎癥反應對聲帶黏膜損傷的機制，為治療聲帶白斑提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1病例資料 所有病例均來源于2013年6月至2015年12月期間在南京軍區南京總醫院耳鼻喉科確診為聲帶白斑且需要接受喉內鏡手術治療的住院患者。入組標準：①術前經24 h雙通道測酸檢查確認伴有LPR的聲帶白斑患者；②年齡>18歲，性別不限；③既往無明確喉部手術史、放療史。排除標準：①有長期吸煙、酗酒史；②孕婦或者哺乳期婦女；③合并有嚴重的全身性疾病、免疫功能缺陷、腫瘤或者其他可能影響結果判斷的患者。共收集符合條件的患者26例，均為男性，年齡38～55歲，平均(42.16±7.05)歲。將26例患者隨機分為質子泵抑制劑(proton pump inhibitor, PPI)組和對照組，每組13例。本研究經過醫院倫理委員會批準(批準號：2017NZKY-009-02)，所有檢查和操作均取得患者知情同意并簽知情同意書。

1.2方法 PPI組給予艾司奧美拉唑鎂腸溶片20 mg口服 (阿斯利康制藥有限公司)，2次/d，連續8周。對照組給予口服胃黏膜保護劑，連續8周。留取手術切除的聲帶黏膜作為檢測標本。術后8周復查纖維喉鏡，夾取聲帶手術區黏膜標本。新鮮組織標本經手術分離后部分立即戊二醛固定，部分立即置于4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，所有標本行HE染色，作病理組織學診斷。所有患者每月定期復查，隨訪時間至少為12個月。

1.3HE染色觀察聲帶組織病理學的變化 HE染色及評分：石蠟包埋、切片行常規染色，光鏡下觀察比較各標本的病理學變化。病理成像系統觀察并拍照；按照病理評分標準對聲帶黏膜病理切片進行評分及統計，按文獻[3]的評分標準：分值范圍在0～4分,分別對應正常黏膜、輕度慢性炎黏膜、中度慢性炎黏膜、重度慢性炎黏膜和極重度慢性炎黏膜。

1.4ELISA法檢測炎癥因子水平 用商品化的ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平。試劑盒購置于R&D公司(USA)。具體操作方法及流程見產品說明書。

2 結 果

2.1患者隨訪結果 術后12個月隨訪，對照組13例中11例復發，PPI組13例中5例復發，2組累計復發率分別為84.6%和38.5%，PPI組復發率明顯低于對照組(Logrank χ2=6.038,P=0.012)，見圖1。

圖1 伴有咽喉反流的聲帶白斑患者復發曲線

2.2HE染色評分 HE染色、光鏡檢測結果顯示，PPI組及對照組術中黏膜炎癥細胞浸潤明顯、局部可見上皮結構破壞。PPI組術后8周的黏膜炎癥細胞浸潤明顯減少、上皮結構完整性明顯改善。與PPI組相比，對照組術后8周的黏膜組織中仍有大量炎癥細胞浸潤、黏膜結構破壞、顯著的黏膜增生甚至異型增生。HE染色檢測表明PPI治療后聲帶黏膜固有層大量浸潤的炎癥細胞得到清除、黏膜組織修復，但仍存在纖維組織增生等情況。

應用炎癥評分標準分析各組標本，結果顯示PPI組與對照組術中標本病理評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。PPI組術后8周病理評分均值較對照組明顯降低(P<0.01)。PPI組術后8周病理評分均值較術中標本病理評分均值明顯降低(P<0.01)。對照組術中標本病理評分均值與術后8周評分均值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

標本采集時間對照組(n=13)PPI組(n=13)術中298±098336±124術后8周312±088146±080?#與對照組術后8周比較，?P<001；與本組術中比較，#P<001

采集標本時間對照組(n=13)PPI組(n=13)TNF?αIL?1βIL?6TNF?αIL?1βIL?6手術中7330±15501613±7513766±6947639±16391549±6313643±693術后8周741±14861587±6983686±7123219±856?#633±212?#1639±398?#與對照組比較，?P<001；與本組手術中比較，#P<001

2.3炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 ELISA檢測顯示，PPI組與對照組術中聲帶黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)。PPI組術后8周聲帶黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯低于對照組(P<0.01)。PPI組術后8周標本與術中標本比較，TNF-α、IL-1β、IL-6表達顯著下調(P<0.01)；對照組術中與術后8周標本TNF-α、IL-1β、IL-6 表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

炎癥特別是慢性炎癥反應在誘導疾病發生及促進腫瘤發展的過程中起到極其重要的作用[4]。微環境中的細胞因子、自由基、酸堿刺激等炎癥遞質，可誘導DNA甲基化、抑癌基因的點突變和翻譯后修飾等變化[5]，引起細胞信號傳導通路的關鍵分子發生改變，破壞正常細胞內環境的穩定性，最終導致病變的發生和進展[6]。咽喉反流物長期刺激聲帶黏膜，可以明顯加重聲帶黏膜的炎癥狀態。在本研究中HE染色檢查可見：伴有LPR聲帶白斑的聲帶黏膜組織中存在大量的炎性細胞浸潤、黏膜結構的破壞、顯著的組織增生甚至異型增生。抑酸治療后浸潤聲帶黏膜固有層的大量炎性細胞得到清除，黏膜組織修復。病理評分結果也證實抑酸治療后，聲帶黏膜的損傷嚴重程度明顯減輕。同時，PPI組術后8周聲帶黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平也較治療前明顯下降，進一步印證抑酸治療可以明顯減輕聲帶黏膜的炎癥程度。咽喉反流物可以加重聲帶黏膜的炎癥已經成為共識，其內在聯系和作用途徑目前仍有爭議，這也是進一步研究關注的重點。

研究證實，在喉部炎癥發生過程中存在著多個細胞信號傳導通路的激活[7-8]，其中NF-κB通路是介導機體內炎癥反應的一條重要的信號通路[9]。目前已有研究表明，NF-kB參與調節免疫反應及炎癥過程，可促進炎癥因子IL-1、TNF-α、IL-6的表達，而這些細胞因子在聲帶白斑發生發展中起重要作用[10-11]。IL-1、TNF-α等炎癥細胞因子釋放，NF-κB激活其下游調控信號途徑可能是反流物加重聲帶白斑的重要原因，但是目前NF-κB激活及其下游的信號途徑尚未清楚，有待于進一步研究和探索。

聲帶白斑的術后復發是臨床棘手問題。近年來，盡管采用了激光、低溫等離子等新的手術技術，但并未降低聲帶白斑復發率[11]。因此，避免和控制引發聲帶白斑的危險因素對于減少聲帶白斑復發就顯得尤為重要[12-13]，其中LPR就是一個重要因素。本研究收集的伴有LPR聲帶白斑患者，術后未予抑酸治療的13例中11例復發，而PPI組13例中5例復發，2組復發率分別為84.6%和38.5%，PPI組復發率明顯低于對照組，2組累計復發率差異有統計學意義。同時，PPI組中術后8周TNF-α、IL-1β、IL-6表達也顯著下調。因此，正規的抑酸治療可以降低伴有LPR的聲帶白斑復發率；相關的炎癥因子可以作為評估聲帶炎癥程度的重要參數。

綜上所述，LPR存在的胃蛋白酶等化學刺激增加了炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6表達，這些因子的釋放，使聲帶組織滲透性提高，加重聲帶的病變甚至使其產生惡變。抑酸治療通過減輕或消除刺激達到抑制炎癥的作用，促進聲帶黏膜結構和功能的恢復。但有關炎癥誘導病變發生發展的分子機制及其關鍵分子對整個網絡調控的規律尚無明確闡述[14]，有待進一步研究和探索。

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Theroleofrelatedinflammatoryfactorsinvocalmucosadamage

WANG Hua-tao1,ZHANG Yong2, WANG Zhi-yi2,JIANG Man-jie2, WU Ming-hai2,PAN Han2, CHENG You2, CHEN Wei2

(1.DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,HuaianHospital，Huaian223200,Jiangsu,China;2.DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China)

R764

A

1672-271X(2017)05-0453-04

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.05.002

2017-03-03;

2017-06-30)

(本文編輯：葉華珍; 英文編輯：王建東)

江蘇省自然科學基金(BK20161388)

1.223200 淮安，淮安市淮安醫院耳鼻咽喉頭頸外科；2.210002 南京，南京軍區南京總醫院耳鼻咽喉頭頸外科

陳 偉，E-mail: jhcw001@163.com

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