右歸丸對去勢骨質疏松大鼠鈣磷代謝和骨代謝的影響*

李健鵬，顏春魯，安方玉，劉永琦，宋 敏，陳 麗，王 鵬，馬正民，牛彥強

(1.甘肅中醫藥大學教學實驗實訓中心，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫藥大學公共衛生學院，甘肅 蘭州 730030； 5.甘肅中醫藥大學臨床學院， 甘肅 蘭州 730030)

·實驗研究·

右歸丸對去勢骨質疏松大鼠鈣磷代謝和骨代謝的影響*

李健鵬1，顏春魯1，安方玉1，劉永琦2，宋 敏3，陳 麗4，王 鵬3，馬正民3，牛彥強5

(1.甘肅中醫藥大學教學實驗實訓中心，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730030； 3.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫藥大學公共衛生學院，甘肅 蘭州 730030； 5.甘肅中醫藥大學臨床學院， 甘肅 蘭州 730030)

目的：觀察右歸丸對去卵巢骨質疏松模型大鼠鈣磷代謝和骨代謝的影響，探討其干預機制。方法：將大鼠隨機分為假手術組，模型對照組，右歸丸低、中、高劑量組，戊酸雌二醇組6組，每組10只。除假手術組外，其余各組采用去卵巢法制備大鼠骨質疏松癥模型，假手術組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪。造模成功后12周，戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09μg/g)灌胃，假手術組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃，右歸丸干預組按高、中、低劑量依次給予右歸丸5，10，20g/kg灌胃，1 d 1次，連續4周。末次給藥結束，檢測股骨組織中的骨密度(bone mineral density，BMD)；股動脈采血檢測血清的鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P )含量，骨鈣素(osteocalcin，BGP)含量和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)含量；處死大鼠，取材計算胸腺、脾臟及腎臟指數，檢測生物力學指標斷裂載荷和定伸長-位移。結果：與模型對照組對比，假手術組大鼠股骨BMD水平、血清BGP、Ca和P含量升高，胸腺指數、脾臟指數和腎指數升高，股骨斷裂載荷、定伸長-位移也升高，而血清trACP含量降低，差別均有統計學意義(P<0. 05)。與模型對照組對比，右歸丸3個劑量組大鼠股骨BMD水平，血清Ca、P和BGP含量、股骨定伸長-位移升高，中、高劑量組胸、脾指數和斷裂載荷升高，高劑量組腎指數亦升高，差別有統計學意義(P<0.05)；而高劑量組大鼠血清trACP的含量則較模型對照組降低，差別有統計學意義(P<0.05)。結論：右歸丸通過提高去卵巢骨質疏松大鼠骨密度和改善骨代謝達到防治骨質疏松的目的。

右歸丸/藥效學；去勢大鼠；BMD；Ca;P;BGP;trACP;臟器指數；斷裂載荷；定伸長-位移；動物；大鼠

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于卵巢功能低下、雌激素缺乏導致骨吸收超過骨形成的一類全身性骨骼障礙性疾病，以骨量減少和骨組織微結構退化為特征，臨床表現主要以各類疼痛、骨折為主[1-2]。目前治療骨質疏松的藥物主要有調節雌激素藥物、骨形成促進藥物、骨礦化促進藥物等西藥，長期服用會引發一系列毒副作用，如陰道出血、血栓形成、冠心病、子宮內膜癌及乳腺癌等，因此，尋找安全、低毒、有效的藥物成為防治骨質疏松的重中之重。中醫學認為，腎主骨生髓，通過補腎方藥可以防治PMOP。右歸丸為中醫“溫補腎陽，填精益髓”的代表方劑，本實驗通過觀察右歸丸對去卵巢骨質疏松模型大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，骨代謝標志物血清鈣(Ca)、磷(P)、骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)，臟器指數，以及股骨生物力學指標斷裂載荷、定伸長-位移的影響，以期為右歸丸在治療PMOP方面的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD雌性大鼠，60只，體質量(180±20)g，由甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

右歸丸由熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12g、當歸9 g、肉桂6 g、制附子6 g等組成。換算成大鼠用量為：111g×0.018×5≈10 g/kg。常規水煎，制成質量分數為1 g生藥/mL的藥液。戊酸雌二醇片，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司產品，批號156A；青霉素，華北制藥股份有限公司產品，批號F6042103。水合氯醛，天津市光復精細化工研究所產品，批號20150105； Rat trACP ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit檢測試劑盒(批號E20151201A)，均為上海源葉生物科技有限公司產品；Ca試劑盒(批號20151127)、P試劑盒(批號20151204)，均為南京建成生物工程研究所產品。iMark型自動酶標分析儀，美國Bio-Rad公司產品；FA2004N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品；ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic產品；TDZ5-WS型醫用離心機，湖南平凡科技有限公司產品；雙能X骨密度儀，美國GE公司產品；AG-IX生物力學萬能實驗機，日本島津公司產品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、戊酸雌二醇組、右歸丸高劑量組、中劑量組、低劑量組6組，每組10只。按照文獻[3-5]方法，以40 g/L水合氯醛(3μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；俯臥位固定，備皮，消毒手術區皮膚；沿背部后正中線做1個1.0～1.5 cm的縱形切口；在乳白色發亮的脂肪團中找到棕黃色的卵巢，沿子宮角處結扎并切除卵巢；逐層縫合傷口。假手術組大鼠，僅切除卵巢周圍脂肪。術后給予青霉素抗感染，大鼠術后注意保溫。造模成功后12 w，給予藥物干預：戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 μg/g)灌胃，假手術組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃，右歸丸干預組按高、中、低劑量依次給予右歸丸5，10，20g/kg灌胃，1 d 1次，連續4周。

1.4 檢測指標

1.4.1 骨密度

末次給藥結束后，采用腹腔注射100 g/L 水合氯醛將各組大鼠麻醉，置于雙能X 線吸收測量儀平臺上，測定右股骨BMD。

1.4.2 血清 BGP、trACP、Ca和P含量

腹主動脈采血，靜置2～3 h，1 500 r/min，離心10 min，分離血清。檢測各組大鼠血清鈣Ca、P、BGP、trACP，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 胸腺指數、脾臟指數和腎臟指數

稱量大鼠體質量，摘取胸腺、脾臟和腎臟并稱量質量，計算各器官指數。胸腺(脾臟、腎臟)指數=胸腺(脾臟、腎臟)質量(mg)/體質量(g)。

1.4.4 斷裂載荷和定伸長-位移

取出完整股骨，將其右側股骨送至陸軍總院，用AG-IX生物力學萬能實驗機檢測斷裂載荷和定伸長-位移等相應指標。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠BMD對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠BMD降低，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，右歸丸各劑量組和戊酸雌二醇組股骨BMD水平均升高，差別有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BMD對比

組 別動物數BMD假手術組100.145±0.004*模型對照組100.116±0.007戊酸雌二醇組100.146±0.006*右歸丸高劑量組100.146±0.004*右歸丸中劑量組100.134±0.005*右歸丸低劑量組100.124±0.004*

注：與模型對照組對比，*P<0.05

2.2 各組大鼠BGP、trACP、Ca和P含量對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠血清BGP、Ca和P含量均降低，trACP含量升高，差別有統計學意義(P<0. 05)。與模型對照組對比，右歸丸各劑量組和戊酸雌二醇組血清BGP、Ca和P含量均升高，右歸丸高劑量組trACP含量降低，差別有統計學意義(P<0. 05)。見表 2。

組 別動物數BGP/(μg·L-1)trACP/(μg·L-1)Ca/(mmol·L-1)P/(mmol·L-1)假手術組102.00±0.20*0.46±0.14*2.07±0.07*0.30±0.02*模型對照組101.04±0.541.38±0.050.92±0.080.10±0.03戊酸雌二醇組101.65±0.17*0.99±0.181.89±0.11*0.22±0.03*右歸丸高劑量組102.04±0.15*0.84±0.09*1.72±0.07*0.24±0.10*右歸丸中劑量組101.55±0.17*0.91±0.081.63±0.12*0.19±0.05*右歸丸低劑量組101.54±0.19*1.21±0.021.13±0.090.18±0.02*

注：與模型對照組對比，*P<0.05

2.3 各組大鼠胸腺指數、脾臟指數和腎臟指數對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠胸腺指數、脾臟指數和腎臟指數均明顯降低，差別有統計學意義(P<0. 05)。與模型對照組對比，右歸丸中、高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠胸腺指數、脾臟指數均顯著升高，高劑量組腎指數升高，差別有統計學意義(P<0. 05)。見表3。

表3 各組大鼠胸腺指數、脾臟指數和腎臟指數對比

組 別動物數胸腺指數脾臟指數腎臟指數假手術組100.329±0.094*0.514±0.061*0.0062±0.0003*模型對照組100.122±0.0280.268±0.0220.0031±0.003戊酸雌二醇組100.297±0.096*0.457±0.110*0.0028±0.002右歸丸高劑量組100.354±0.099*0.535±0.081*0.0052±0.0001*右歸丸中劑量組100.288±0.069*0.480±0.055*0.0035±0.002右歸丸低劑量組100.234±0.0470.409±0.0410.0031±0.001

注：與模型對照組對比，*P<0.05

2.4 各組大鼠斷裂載荷、定伸長-位移參數對比

與假手術組對比，模型對照組大鼠股骨的結構力學參數斷裂載荷、定伸長-位移等均下降，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，右歸丸中、高劑量組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷參數，右歸丸各干預組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠定伸長-位移參數，差別有統計學意義(P<0.05)。見表4。

組 別動物數斷裂載荷/mPa定伸長-位移/KPa假手術組10142.17±0.15*1.45±0.021*模型對照組1086.22±0.090.17±0.012戊酸雌二醇組10122.17±0.14*0.54±0.014*右歸丸高劑量組10115.36±2.84*0.43±0.021*右歸丸中劑量組10110.61±0.52*0.33±0.020*右歸丸低劑量組1095.57±3.210.26±0.025*

注：與模型對照組對比，*P<0.05

3 討 論

將骨質疏松屬中醫學“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫認為，腎主骨，腎精充實則骨得其養，骨髓生化有源、堅固；腎精虧虛則骨失其養，骨髓化生乏源、骨骼脆弱；因此，腎虛精虧是骨質疏松的主要病機，治則以補腎為主[6]。右歸丸方中以附子、肉桂、鹿角膠為君藥，溫補腎陽，填精補髓；以熟地黃、枸杞子、山茱萸和山藥為臣藥，發揮滋陰益腎、養肝補脾之功效；佐以菟絲子補陽益陰，固精縮尿；杜仲補益肝腎，強筋壯骨；當歸養血活血，助鹿角膠以補養精血。諸藥合用,共奏溫補腎陽、填精止遺之效。

在骨代謝中，血液和尿液的生化指標是判定指標之一[7]。摘除卵巢后的大鼠腎臟尿鈣排出增加，促進了血鈣和骨鈣的急劇減少，使骨形成和骨鈣化能力進一步降低，導致骨骼中沉積的礦物質逐步減少，BMD和骨量降低，骨骼脆性增加，引發骨質疏松甚至骨折[7-8]。另外，機體摘除卵巢后，骨吸收大于骨形成，導致骨量增加受阻和骨生物力學發生改變。也有文獻[9-11]證明，一些補腎壯骨中藥能夠抑制骨質疏松中骨密度的減少，明顯改善骨生物力學參數的變化，升高骨質疏松大鼠BGP含量，降低trACP含量。本實驗發現：右歸丸能明顯升高去卵巢模型大鼠血清中鈣、磷含量，顯著改善鈣、磷代謝，促進骨組織鈣化。同時，右歸丸能夠明顯抑制去卵巢大鼠所致的骨密度丟失，升高卵巢大鼠的胸脾指數和BGP含量，降低trACP的含量，這些結果均與以往研究相一致，說明右歸丸在骨質疏松防治方面具有一定效果。

綜上所述，右歸丸能明顯提高去卵巢骨質疏松模型大鼠的骨密度和骨強度，可能是通過對鈣、磷代謝，BGP和trACP代謝的調節而發揮預防和治療骨質疏松的作用。

[1]LEWIECKI EM.New targets for intervention in the treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Nat Rev Rheumatol,2011,7(11): 631-638.

[2]CHANG SF,HONG CM,YANG RS. Global computer-assisted appraisal of osteoporosis risk in Asian women: an innovative study[J]. J Clin Nurs,2011,20(9/10): 1357-1364.

[3]巢傳琦, 蔡君, 呂俊華, 等. 補骨方對去卵巢大鼠骨質疏松的防治作用研究[J].中藥材,2015,38(4): 807-809.

[4]王琳, 吳紀凱, 范淦彬, 等.補骨制劑Ⅱ對摘除卵巢大鼠骨質疏松的防治作用[J].中國老年學雜志,2015,35(6): 1633-1635.

[5]王權, 毛穎, 馬春暉, 等. 鹿骨粉治療大鼠卵巢摘除后所致的骨質疏松[J].中國婦幼保健,2015,30(17): 2861-2864.

[6]戎堃, 劉彬麗, 李木子, 等. 中藥防治骨質疏松的研究進展[J].世界中醫藥,2013,8(12): 1505-1507.

[7]郭魚波, 王麗麗, 馬如風, 等. 女貞子水提液對去卵巢大鼠骨結構和骨代謝的影響研究[J].中草藥, 2016, 47(7): 1155-1162.

[8]張林, 范穎, 陳文娜, 等. 補腎、健脾和補腎健脾方對尾部懸吊大鼠鈣、磷代謝的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(12): 193-196.

[9]張瑤, 張維麗,馬威, 等. 補腎健脾湯對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨代謝指標的影響[J].中華中醫藥雜志, 2016, 31(3): 864-867.

[10]孫平, 胡伶平, 董群偉, 等. 復方貞術調脂膠囊對糖皮質激素誘導骨質疏松大鼠股骨和腰椎骨密度及生物力學特性的研究[J].中國骨質疏松雜志,2016,22(2): 135-138,144.

[11]王權,毛穎, 馬春暉, 等. 鹿骨粉治療大鼠卵巢摘除后所致的骨質疏松[J].中國婦幼保健, 2015, 30(17): 2861-2864.

1001-6910(2017)10-0064-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.10.27

顏春魯，副教授，碩士，yanchl1979@126.com

甘肅省高等學校科研項目(2015A-097)；甘肅中醫藥大學教學研究與教學改革項目(ZH-201606)；甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究重大實驗室開放基金(FZYK15-16-7)

2017-07-05；

2017-08-25

(編輯 陶 珠)