HPLC法測定甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì)

李志偉，張任飛，劉穎娜，禹葉廣，謝英花，仇燕

(1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

HPLC法測定甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì)

李志偉1，張任飛1，劉穎娜1，禹葉廣1，謝英花1，仇燕2

(1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

建立了一種高效液相色譜(HPLC)法，用于檢測甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì).該法采用SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為90∶10)為流動相A，20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為30∶70)為流動相B，按梯度洗脫程序洗脫.該方法的檢測波長為290 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL.結(jié)果表明，甲苯磺酸依度沙班及各雜質(zhì)均能有效分離；在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，各物質(zhì)的線性關(guān)系良好；各雜質(zhì)的回收率均在98.0%～102.0%，RSD(n=9)均小于2.0%；在色譜條件有微小變化時，各物質(zhì)均能有效分離且雜質(zhì)含量的差異在可接受范圍內(nèi).經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法專屬性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、耐用性好，可用于甲苯磺酸依度沙班的質(zhì)量控制.

甲苯磺酸依度沙班；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法;質(zhì)量控制

甲苯磺酸依度沙班(edoxaban tosilate hydrate)是由日本第一三共株式會社研制的一種口服小分子抗凝血藥物，可用于治療靜脈血栓和全髖關(guān)節(jié)置換[1-3].甲苯磺酸依度沙班通過高選擇性直接抑制凝血因子Xa的表達(dá)，起到抗凝血作用，其對Xa的選擇性較對凝血酶高10 000倍，對其他絲氨酸蛋白酶無作用[4].甲苯磺酸依度沙班片于2011年在日本上市，2015年先后在美國和歐洲上市[5-7]，目前還未在國內(nèi)上市.

為了保證藥物的安全性、可靠性，需對甲苯磺酸依度沙班的雜質(zhì)進(jìn)行研究.目前，有諸多文獻(xiàn)報道甲苯磺酸依度沙班的合成、藥理學(xué)、藥效學(xué)和藥動學(xué)[8-11]，但甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì)的檢測方法未見報道.本文根據(jù)甲苯磺酸依度沙班的合成路線，建立了一種液相色譜測定甲苯磺酸依度沙班及其雜質(zhì)的方法.按加校正因子的主成分對照法計算雜質(zhì)含量，其中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)E分別為甲苯磺酸依度沙班的起始原料1、起始原料2和起始原料3；雜質(zhì)C和雜質(zhì)D分別為甲苯磺酸依度沙班中間體1和中間體2；雜質(zhì)F為合成中間體1中的副產(chǎn)物；雜質(zhì)G、雜質(zhì)H和雜質(zhì)I為甲苯磺酸依度沙班的非對映異構(gòu)體，即SRR-依度沙班，RRR-依度沙班和SSR-依度沙班.甲苯磺酸依度沙班和各雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式分別見圖1和圖2.

圖1 甲苯磺酸依度沙班-水合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of edoxaban tosilate hydrate

圖2 甲苯磺酸依度沙班雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of impurities of edoxaban tosilate hydrate

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU高效液相色譜儀(包括SCL-10Avp控制器，DGU-14A脫氣機(jī)，LC-10ADvp泵，SIL-10ADvp進(jìn)樣器，CTO-10ACvp柱溫箱，SPD-10AV檢測器及LC solution工作站)；Waters高效液相色譜儀(包括Waters 2695 Separations Module和Waters 2996 Photodiode Array Detector)；AUW120D電子天平(SHIMADZU)；pH計，pHS-3C，上海精科；乙腈，色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司.甲苯磺酸依度沙班、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I(自制，石家莊佰銳生物科技有限公司)，甲苯磺酸依度沙班(石家莊佰銳生物科技有限公司，批號：20141101、20141102、20141103).

1.2 色譜條件

色譜柱：SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為90∶10)，流動相B為20 mmol/L磷酸氫二鉀(pH 4.0)-乙腈(體積比為30∶70)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為290 nm，進(jìn)樣量為10 μL.

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 溶液配制

雜質(zhì)F儲備液：取雜質(zhì)F適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋制成每1 mL含0.05 mg的雜質(zhì)F儲備液.

其他雜質(zhì)儲備液：分別取雜質(zhì)A、E、C、D、G、H、I、甲苯磺酸依度沙班對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇溶解并稀釋制成1 mL中約含0.5 mg的各雜質(zhì)一級儲備液.取上述雜質(zhì)的一級儲備液2.5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液.

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密量取雜質(zhì)A、E、C、D、G、I、H儲備液各5 mL，雜質(zhì)F儲備液2.5 mL以及甲苯磺酸依度沙班對照品適量(約含依度沙班25 mg)，置于同一50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，制成每1 mL中約含2.5 μg的各雜質(zhì)對照品和每1 mL中約含0.5 mg依度沙班對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

供試品溶液：取本品適量(含依度沙班約25 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

取甲苯磺酸依度沙班、雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I適量，用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，于190～400 nm波長內(nèi)掃描，甲苯磺酸依度沙班和大部分雜質(zhì)在290 nm附近有強(qiáng)吸收，因此選擇290 nm作為檢測波長.雜質(zhì)B的最大吸收波長在206 nm，在290 nm處無吸收，該雜質(zhì)在中間體1的過程中嚴(yán)格控制，因此不作為本文考察的雜質(zhì).

2.1.2 色譜柱的選擇

在梯度洗脫程序確定前，首先對色譜柱進(jìn)行篩選，包括：Agela Venusil ASD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，SHIMADZU HRC-C8(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，Waters SunFire C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱.在相同的分析條件下，4根不同品牌的色譜柱都不能將主峰與其后的雜質(zhì)分離，但Waters SunFire C8 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對雜質(zhì)的分離優(yōu)于其他色譜柱，因此最終確定選用Waters SunFire C8 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱作為甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì)的分析色譜柱.

2.1.3 pH值的選擇

在梯度洗脫程序確定后，本文考察了pH值對雜質(zhì)分離度的影響.將磷酸鹽緩沖液的pH值調(diào)整為7.0、5.5、4.0、3.0對雜質(zhì)進(jìn)行分析.實驗結(jié)果表明，隨著pH值的減小，雜質(zhì)的分離度增強(qiáng)，當(dāng)pH值為7.0和5.5時，該梯度洗脫程序不能將雜質(zhì)全部分離，當(dāng)pH值為4.0和3.0時，各物質(zhì)均能有效分離，但考慮到色譜柱pH值的耐用范圍，確定磷酸鹽緩沖液的pH值為4.0.

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性

取空白溶劑(甲醇)、標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液和各雜質(zhì)定位溶液，按“1.2”節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰順序雜質(zhì)E、雜質(zhì)D、對甲苯磺酸、依度沙班、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)F，且空白溶劑不干擾甲苯磺酸依度沙班和各雜質(zhì)的檢測，且各雜質(zhì)間最小的分離度為1.775，達(dá)到分離要求，實驗結(jié)果表明該法專屬性良好.實驗結(jié)果見圖3.

圖3 專屬性實驗對比Fig.3 Chromatograms comparison of methanol and standard solution

2.2.2 系統(tǒng)精密度

按“1.3”節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，于“1.2”節(jié)的分析方法下連續(xù)進(jìn)樣6次，雜質(zhì)E峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.55%，其他各物質(zhì)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.0%.實驗結(jié)果表明，雜質(zhì)E不穩(wěn)定，就其他物質(zhì)而言，該方法系統(tǒng)適用性良好.

2.2.3 降解實驗

酸降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸2 mL，于室溫下放置24 h后，加2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制酸空白溶劑做空白實驗.

堿降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉2 mL，于室溫下放置5 min后，加2 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中和，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制堿空白溶劑做空白實驗.

氧化降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 30%雙氧水，于室溫下放置24 h后，用甲醇溶解定容并稀釋至刻度，搖勻，測定.另取同法配制氧化空白溶劑做空白實驗.

高溫固體降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，于80 ℃烘箱中放置24 h后，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定.

光照降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，于照度為 4 500 lx下放置24 h后，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定.

A.未破壞；B.酸破壞；C.堿破壞；D.光照液體；E.氧化破壞；F.高溫固體破壞；G.光照固體破壞.圖4 降解實驗色譜Fig.4 Chromatograms of forced degradation test

光照液體降解實驗：取甲苯磺酸依度沙班約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，于4 500 lx下放置24 h后進(jìn)行測定.

照上述分析方法測定，各條件下降解實驗的物料守恒值均在90%～110%，遵循物料守恒原則，且主峰的純度角度值均小于閾值，表明峰純度符合要求.本品在酸、堿、氧化條件下有雜質(zhì)產(chǎn)生，酸降解實驗產(chǎn)生了雜質(zhì)E和2個未知雜質(zhì)；堿降解實驗產(chǎn)生了雜質(zhì)E和1個未知雜質(zhì)；氧化降解實驗產(chǎn)生了雜質(zhì)E和3個未知雜質(zhì).各條件下雜質(zhì)均能達(dá)到有效分離，表明該方法專屬性強(qiáng).實驗結(jié)果見圖4.

2.2.4 檢測限與定量限

以信噪比S/N=3時的濃度作為檢測限，S/N=10時的濃度作為定量限，并取定量限溶液進(jìn)行重復(fù)性實驗，定量限重復(fù)性實驗峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.0%，實驗結(jié)果見表2和圖5.

表2 檢測限、定量限實驗結(jié)果Tab.2 Results of LOD and LOQ

圖5 定量限圖譜Fig.5 Chromatogram at the limit of quantitation of edoxaban tosilate hydrate and its impurities

2.2.5 線性與范圍

取甲苯磺酸依度沙班和各雜質(zhì)儲備液適量，用甲醇稀釋成6個不同質(zhì)量濃度的混合溶液，按“1.2” 節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，以各物質(zhì)的線性質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸.實驗結(jié)果表明，各物質(zhì)在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.線性實驗結(jié)果見表3.

表3 線性實驗結(jié)果Tab.3 Results of linearity test

2.2.6 重復(fù)性

按“1.3”節(jié)的溶液配制方法配制6份供試品溶液和自身對照溶液，分別進(jìn)行色譜分析，6份供試品溶液中均未檢測出已知雜質(zhì)，均檢測到同一未知雜質(zhì)，未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.044%，RSD為3.81%，小于4.0%，符合要求.實驗結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好.

2.2.7 中間精密度

由不同人員于不同時間按“重復(fù)性”項下操作，進(jìn)行樣品測定，6份供試品溶液中均未檢測出已知雜質(zhì)，均檢測到同一未知雜質(zhì)，未知雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.047%，RSD為4.32%，小于5.0%.與重復(fù)性結(jié)果共計，12份樣品未知雜質(zhì)含量的RSD為5.20%，小于6.0%.實驗結(jié)果表明，該方法中間精密度良好.

2.2.8 溶液穩(wěn)定性

按“1.3”節(jié)配制供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣分析，考察其穩(wěn)定性.經(jīng)測定，雜質(zhì)E峰面積的RSD為13.83%，其余各物質(zhì)峰面積的RSD均小于2.5%，則說明雜質(zhì)E不穩(wěn)定，需臨用現(xiàn)配，其他各雜質(zhì)在室溫下放置8 h穩(wěn)定.供試品溶液的雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.042%，RSD為3.94%，小于4.0%，說明甲苯磺酸依度沙班溶液在室溫下放置8 h穩(wěn)定.

2.2.9 回收率

分別向甲苯磺酸依度沙班中加入80%、100%、120% 3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雜質(zhì)溶液，每個質(zhì)量濃度平行配制3份溶液，按“1.2”節(jié)測定，按外標(biāo)法計算各雜質(zhì)的回收率，各雜質(zhì)的回收率均在98%～102%，RSD均小于2.0%.實驗結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高.實驗結(jié)果見表4.

表4 回收率實驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery test

2.2.10 耐用性

本實驗主要考察了在流速改變±0.1 mL/min，流動相乙腈體積分?jǐn)?shù)改變±2%，柱溫變化±5 ℃，pH調(diào)節(jié)±0.1條件下各雜質(zhì)的分離情況和供試品的雜質(zhì)含量.在上述條件下，各雜質(zhì)的分離度均大于1.5，符合分離要求；供試品總雜質(zhì)在各個條件下的RSD最大為5.92%.實驗結(jié)果表明，該方法在適量改變(流速±0.1 mL/min，流動相乙腈比例±2%，柱溫± 5℃，pH±0.1)范圍內(nèi)耐用性良好.

2.3 樣品測定結(jié)果

取中試3批(批號為：20141101、20141102、20141103)樣品，按照上述方法進(jìn)行測定， 3批樣品均未檢測出已知雜質(zhì)，未知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.049%、0.053%、0.051%.

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜分析方法，用于檢測甲苯磺酸依度沙班的有關(guān)物質(zhì)，采用加校正因子的自身對照法計算雜質(zhì)含量.實驗結(jié)果表明，方法專屬性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，耐用性好，可用于甲苯磺酸依度沙班有關(guān)物質(zhì)的檢測.

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[6] DAIICHI SANKYO COMPANY LIMITED.Daiichi Sankyo’s once-daily Lixiana (edoxaban)receives positive CHMP opinion for the prevention of stroke and systemic embolism in non-valvular atrial fibrillation and for the treatment and prevention of recurrent venous thromboembolism in Europe.http://www.daiichisankyo.com/media_investors/media_relations/press_releases/detail/006278/20150427_571_ E.pdf.

[7] DAIICHI SANKYO COMPANY LIMITED.SAVAYSATM (edoxaban)now available in U.S.pharmacies.http://www.daiichisankyo.com/media_investors/media_relations/press_releases/detail/006247.html.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

DeterminationofrelatedsubstancesinedoxabantosilatehydratebyHPLC

LIZhiwei1，ZHANGRenfei1,LIUYingna1，YUYeguang1，XIEYinghua1，QIUYan2

(1.College of Chemical &Pharmaceutical Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.College of Bioscience &Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

A HPLC method was established to separate edoxaban tosilate hydrate and its related substances.SunFire C8 (250 mm×4.6 mm,5 μm)column was adopted in the analysis method and its temperature was kept at 30 ℃.The mobile phase A consisted of 20 mmol/L K2HPO4(pH 4.0)-acetonitrile (90∶10,V/V)and the mobile phase of B consisted of 20 mmol/L K2HPO4(pH 4.0)-acetonitrile (30∶70,V/V).A gradient elution at flow of 1.0 mL/min was used.The detection wavelength was 290 nm and the injection volume was 10 μL.The calibration curve of all substances were linear in appropriate concentration range,and the average recovery of all compounds were among 98.0%～102.0%,RSD (n=9)values were less than 2.0%.Each impurity was separated when the parameters had small changes and the assay variation of impurities was accepted.Methodology validation results proved that the method had good selectivity,high sensitivity,high accuracy and good robustness and it can be used for quality control of edoxaban tosilate hydrate.

edoxaban tosilate hydrate；related substances;HPLC；quality control

O29

A

1000-1565(2017)05-0489-08

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.008

2016-12-25

河北省自然科學(xué)基金資助項目(C2014208084)

李志偉(1977—),男，河北唐縣人，河北科技大學(xué)副教授，主要從事藥物分析和分離材料方面的研究.E-mail：lizhiwei@hebust.edu.cn