可產木聚糖酶的蕙蘭根內生細菌的篩選與鑒定

馬春玲，李思含，趙東芳，李廣碩，馬睿憶，孫磊

(河北大學 生命科學學院 河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002)

可產木聚糖酶的蕙蘭根內生細菌的篩選與鑒定

馬春玲，李思含，趙東芳，李廣碩，馬睿憶，孫磊

(河北大學 生命科學學院 河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002)

為了獲得可產木聚糖酶的功能菌，通過剛果紅染色法對592株蕙蘭(Cymbidiumfaberi)根內生細菌進行初篩，DNS法對初篩獲得的菌株進行復篩，并通過形態學、生理生化特性、(G+C)的物質的量分數及16S rRNA基因序列分析對菌株進行初步鑒定.結果篩選出31株可產木聚糖酶的菌株，占篩選總菌株數量的5.23%，其中7株產酶活性較強；復篩結果顯示菌株6hRe76產木聚糖酶活力最高，其發酵液木聚糖酶酶活為57.15 U/mL，初步鑒定該菌株為克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis).該研究為木聚糖酶的生產提供了潛在的新資源.

木聚糖酶；類芽孢桿菌；內生細菌

木聚糖是半纖維素的主要成分，也是自然界中僅次于纖維素的第2大類可再生的生物物質，可以被降解為有用的產物[1].木聚糖主要存在于植物細胞的細胞壁和中膠層[2]，其基本分子結構是D-木糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵相連構成線性分子主鏈，主鏈上帶有乙酰基、阿拉伯糖殘基[3].木聚糖完全水解需要多種酶相互結合才能完成，起主要作用的包括內切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)和β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)等[4].木聚糖酶隨機水解β-1,4-糖苷鍵產生低聚木糖和少量木糖，然后β-木糖苷酶進一步水解低聚木糖釋放木糖殘基[5].從半纖維素中獲取低聚木糖、木糖的有效途徑就是通過木聚糖酶的水解，木聚糖酶已經在飼料、造紙及食品[6]等行業得到了廣泛應用.因此對木聚糖酶的研究對于可再生資源的有效利用具有重要意義.

許多微生物包括細菌、真菌和酵母都能產生不同類型的木聚糖酶.植物內生細菌指能在健康植物組織內棲居而對植物無實質性危害的細菌，其中一部分還能使植物受益，并與植物建立和諧聯合關系的微生物，植物內生細菌具有多種重要的功能，如促生、生防、促進植物修復等[7]，同時內生細菌還能分泌抗菌、抗病毒、抗癌及酶等多種活性物質[8].植物內生細菌作為活性物質的重要來源日益受到人們的重視.

本研究主要以植物內生細菌為材料篩選獲得可產木聚糖酶的功能菌株，以期獲得可產木聚糖酶的新資源.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 內生細菌

分離自蕙蘭的592株根內生細菌.

1.1.2 培養基

1)菌種純化培養基(LB培養基)：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min.

2)初篩培養基[9]：玉米芯木聚糖10.0 g，酵母粉0.3 g，(NH4)2SO45.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌30 min.

3)產酶培養基[10]：麩皮40.0 g，蛋白胨5.0 g，K2HPO45.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的初篩

將實驗室保藏的592株蕙蘭根內生細菌活化后點接至以玉米芯木聚糖為碳源的初篩培養基平板上，30 ℃培養2 d，然后用剛果紅對初篩平板染色，觀察并記錄透明圈的大小[11].

1.2.2 菌種的復篩

將初篩得到的菌株接種于LB培養基中培養24 h獲得種子液，再以10%的接種量接種于液體產酶培養基中，30 ℃，180 r/min，搖床振蕩培養24 h，然后吸取發酵液， 4 000 r/min離心10 min，其上清液即為粗酶液，用于測定木聚糖酶活力.

1.2.3 木聚糖酶活力測定

木聚糖酶活力測定采用DNS法[12].木聚糖酶活力單位：以木糖為標準，每min產生1 μmoL木糖所需酶量定義為1個酶活力單位(U).計算公式為U=N×G/(V×t×m)，式中N為酶液稀釋倍數，G為酶解溶液木糖含量，V為加酶量，t為酶解時間，m為木聚糖質量分數.

1.2.4 菌株的鑒定

1)產酶菌株的16S rRNA基因序列分析采用細菌16S rRNA基因通用引物27f[13](5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492r[14](5-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3)對其進行擴增.反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸7 min.PCR產物經切膠回收后由北京寶銳通生物技術有限公司測序，測序結果提交EzTaxon數據庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)進行序列比對，選取同源性較高的序列用鄰接法(neighbor-joining method)[15]進行分析，采用Mega7.0構建系統發育樹.

2)菌落形態觀察和生理生化鑒定：在平板培養基上觀察菌落形態、顏色，對培養24 h的菌株進行革蘭氏染色和鞭毛染色，并對該菌進行接觸酶實驗、氧化酶實驗、VP實驗及甲基紅實驗[16]，同時進行Biolog實驗.

3)產酶菌株(G+C)的物質的量分數測定：采用HPLC法[17]測定菌株基因組(G+C)的物質的量分數.

2 結果

2.1 初篩結果

利用剛果紅對592株蕙蘭根內生細菌染色，比較透明圈大小，進行木聚糖酶產生菌的篩選，結果見表1.共篩選出可產木聚糖酶的功能菌31株，占篩選總菌株數量的5.23%；其中7株為功能較強菌株，占功能菌株數量的22.6%.根據初篩結果，選定菌株6hRe76、6hRe1、N58-1、T58-1、ahR29、hRa12、ahR12進行復篩.

表1 部分木聚糖酶產生菌株的水解圈直徑與菌落直徑的比值Tab.1 Hydrolysis circle diameter to colony diameter ratio of xylanase-producing strains

2.2 復篩結果

利用DNS法對選定的7株細菌進行發酵產酶測定，實驗結果如表2所示.其中木聚糖酶活力最高的是培養1 d后的菌株6hRe76的發酵液，其酶活性為57.15 U/mL.此菌株為篩選到的可產木聚糖酶的功能菌株，對其進行鑒定.

表2 復篩菌株木聚糖酶活力測定結果Tab.2 Xylanase activity determination results of secondary screening strains

2.3 菌株鑒定結果

2.3.1 菌株6hRe76的16S rRNA基因序列分析

將菌株6hRe76的16S rRNA基因序列提交GenBank，序列登錄號為(MF359544).在 EZTaxon 數據庫中作比對分析，并構建系統發育樹(圖1).如圖1所示，菌株6hRe76與克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis)(AF391123)在同一個分支中，序列相似性為99%.根據此結果,菌株6hRe76可初步鑒定歸屬于類芽孢桿菌屬.

括號內數字為GenBank 登錄號；分支數表示1 000次Bootstrap 重抽樣分析的支持百分比；圖例0.005為遺傳距離.圖1 鄰接法構建菌株6hRe76及其相關菌株16S rRNA基因的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain 6hRe76 and related strains by neighbor-joining method

2.3.2 菌落形態特征觀察

菌株6hRe76在LB培養基上培養2 d，菌落表面光滑,半透明,微黃色,邊緣不規則.革蘭氏染色可變(圖2)，周生鞭毛(圖3).

a.革蘭氏陰性(培養2 d的染色結果)；b.革蘭氏陽性(培養7 d的染色結果).圖2 革蘭氏染色結果(1 000×)Fig.2 Result of Gram staining(1 000×)

圖3 鞭毛染色結果(1 000×)Fig.3 Result of flagellum staining(1 000×)

2.3.3 菌株生理生化特征測定

菌株6hRe76呈氧化酶陰性,接觸酶陽性,甲基紅反應陰性,VP實驗結果陽性.該菌與克里布所類芽孢桿菌的菌落形態特征、革蘭氏染色特征及接觸酶等生理生化特征一致.

Biolog測定結果顯示,菌株6hRe76可利用的糖類包括D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖等,氨基酸的種類包括D-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸,羧酸及酯和脂肪酸包括氨基乙酰-L-脯氨酸、D-半乳糖醛酸等.在pH5、pH6、10 g/L NaCl條件下可生長,能夠利用乳酸鈉、鹽酸胍、亞碲酸鉀.

2.3.4 菌株6hRe76的(G+C)的物質的量分數

通過HPLC法測得菌株6hRe76的(G+C)的物質的量分數為47.10%，類芽孢桿菌屬的(G+C)的物質的量分數為45%～54%.

根據形態特征、生理生化特征、(G+C)的物質的量分數及16S rRNA基因系統發育分析，菌株6hRe76被鑒定為克里布所類芽胞桿菌(Paenibacilluskribbensis).

3 討論

木聚糖酶在自然界廣泛存在，現已發現幾十個屬的100多個種的微生物可產木聚糖酶.目前報道較多的高產木聚糖酶的是真菌[18]和芽孢桿菌屬的細菌[19].真菌所產木聚糖酶的活性高于細菌，但是細菌所產木聚糖酶的耐堿性及耐熱性要優于真菌[20].類芽孢桿菌屬目前至少包含202個種(LPSN,http://www.bacterio.net/)，類芽孢桿菌屬的細菌具有多種生物活性，也已發現多種類芽胞桿菌具有產木聚糖酶的能力，如Paenibacilluscurdlanolyticus[21]、Paenibacillusterrae[22]、Paenibacilluscampinasensis[23]、Paenibacillusfavisporus[24]等.本研究從592株植物內生細菌中篩選到1株可產木聚糖酶的菌株6hRe76，經鑒定為克里布所類芽胞桿菌，為木聚糖酶產生菌提供了新資源.

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(責任編輯：趙藏賞)

Screeningandidentificationofxylanase-producingendophyticbacteriaofCymbidiumfaberiroots

MAChunling,LISihan,ZHAODongfang,LIGuangshuo,MARuiyi,SUNLei

(1.Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to obtain the xylanase-producing functional strains,592 endophytic bacteria fromCymbidiumfaberiroots were screened by using the method of Kongo red dye according to the size of hydrolyzed circle.The xylanase activity of strains screened was re-screened by DNS.The xylanase-producing strain was identified based on its morphological,physiological and biochemical characteristics,mole fraction of (G+C)and 16S rRNA gene sequence analysis.The results showed that 31 xylanase-producing strains were obtained,which account for 5.23% of the total strains.Seven strains with high xylanase yields were screened through DNS method.Strain 6hRe76 with the highest enzyme activity was obtained,of which the activity of xylanase was 57.15 U/ mL.The strain 6hRe76 was identified asPaenibacilluskribbensis.The research provided the new source for xylanase production.

xylanase;Paenibacillus;endophytic bacteria

Q939.13

A

1000-1565(2017)05-0518-05

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.05.011

2017-06-22

國家自然科學基金資助項目(31100002)；河北省生物工程重點學科經費資助項目；河北大學大學生創新創業項目(2016063)

馬春玲(1992—)，女，河北邢臺人，河北大學碩士研究生，主要從事微生物資源開發研究.E-mail: 799169587@qq.com

孫磊(1971—)，女，河北唐山人，河北大學教授，博士，主要從事環境微生物學研究.E-mail: sunlei1018@126.com